Introducción a la Microscopía de Fluorescencia Renzo Gavilanez Motic Instruments, Inc

Microscopía de Fluorescencia Contenido: Principio Aplicaciones Para Ciencias de la Vida Para Ciencias de Materiales Equipo necesario Microscopio Fuentes de Luz Juego de Filtros Selección de filtros Lentes Objetivos

Fluorescencia Espectro de luz visible: La longitud de onda determina el color

Fluorescencia ¿Qué es? Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia en el cual un material absorbe radiación de una fuente específica y muy rápidamente emite luz cuya energía es menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación que ha absorbido.

Fluorescencia Espectro de luz visible: Excitación Emisión

Fluorescencia ¿Cómo se produce? Los electrones son excitados a estados vibracionales y rotacionales más altos y cuando vuelven a su estado fundamental emiten la energía de excitación en forma de radiación.

Fluorescencia (definiciones) ● Debido a la disipación interna de energía la luz emitida tiene siempre una longitud de onda mayor (menor energía) que la luz de excitación. ● La cantidad de luz emitida es muy pequeña en comparación con la utilizada para la excitación. ● Los materiales que fluorescen lo hacen porque contienen estructuras con configuraciones moleculares particulares conocidas como fluoróforos o fluorocromos.

Fluorescencia (definiciones) ● Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor energía (mayor longitud de onda). ● Un fluoróforo es la parte del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia.

Fluorescencia (definiciones) Tipos de fluorescencia: ● La fluorescencia primaria es la que se da porque existe una configuración inherente a la estructura molecular. Algunas de las fluorescencias más intensas que se observan se asocian con moléculas aromáticas, la fluorescencia de materiales inorgánicos se observa en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos específicos: Clorofila, aceite de inmersión, GFP

Fluorescencia (definiciones) Tipos de fluorescencia: ● La fluorescencia secundaria ocurre cuando una molécula específica o un grupo capaz de fluorescer, un fluorocromo, se introduce en la estructura de la muestra. Éste es el procedimiento para la mayoría de las aplicaciones biológicas de la microscopía de fluorescencia.

Fluorescencia Espectros de excitación y emisión: Debido a la diferente configuración electrónica de los fluorocromos cada uno presenta un espectro de excitación y de emisión característico y único. Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y el pico de máxima emisión o bien los espectros de excitación y emisión.

Fluorescencia Espectros de excitación y emisión: Fluoresceína (FITC) pH = 9 pH = 13

Fluorescencia ¿Porqué usar Fluorescencia? Para facilitar pequeñas estructuras debido al alto contraste de la imagen sobre el fondo (buena relación señal a ruido) Fondo Negro (pupilas se abren apliamente)

Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones Ciencias de la Vida Inmunohistoquímica/Histología Para identificar la distribución de una proteína específica dentro de un tejido, un fluorocromo puede ser usado para marcar la proteína vía un anticuerpo 2. Biología Para monitorear rápidamente concentraciones fisiológicas cambiantes de iones, e.g. calcio, magnesio y valores pH en células vivas. Para estudiar viabilidad de tejidos animales/humanos y patógenos.

Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones EGFP expression in muscles of C. elegans Filtersystem: EGFP longpass GFPs como proteína que se expresa en cuerpos vivos (GFP: Proteína fluorescente verde, de medusa Aequorea)

Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones Dapi FITC Cy 3 Cy 3.5 Cy 5 Cy 7 Cromosomas con 6 fluorocromos

FISH (Fluorescence in situ Hybridisation) Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones FISH (Fluorescence in situ Hybridisation)

Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones II. Ciencia de Materiales Inspección de Circuitos electrónicos Investigación de contaminantes en wafers semiconductores Estudios de sedimentación petrológica en rocas

Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones Huecos en concreto

Equipo Necesario Que equipo se requiere? Microscopio con accesorio de fluorescencia Fuente de luz: HBO 50/100 Watt o LED Set de Filtros (3 filtros en 1 cubo) Objetivos con alta apertura numérica (A.N.)

Equipo Necesario

Equipo Necesario Fuente de poder Accesorio de fluorescencia Caja de lámpara Cubos con filtros

Equipo Necesario

Equipo Necesario

Equipo Necesario La lámpara de mercurio Lámpara de mercurio HBO100Watt Arco de dimensión pequeña Gran cantidad de energía Relación Excitación/Emisión 10000:1 Conclusión: Utiliza cada fotón disponible

Equipo Necesario Las lámparas LED o de Aluro Metálico Lámpara LED específica para cada longitud de onda, larga vida, no requiere reemplazo de lámpara, no caliente, no se requiere centrado, permite controlar intensidad Lámpara Aluro Metálico genérica para todas las longitudes de onda, larga vida, no requiere reemplazo de lámpara, no caliente, no se requiere centrado, permite controlar intensidad

Equipo Necesario El cubo con filtros Filtro de Excitación Espejo dicróico Filtro de Barrera o Emisión (longpass, bandpass)

Filtros Estándard de Fluorescencia DAPI & Hoechst: Exciter D350/50 Dichroic 400LP Emitter D460/50 FITC: Exciter D480/30 Dichroic 505LP Emitter D535/40 TRITC/Cy3: Exciter D540/25X Dichroic 565DCLP Emitter D605/55m

Especificacón del Filtro - FITC Perfiles de Absorción y Emisión

Selectividad de Filtros DAPI

Selectividad de Filtros FITC

Selectividad de Filtros TRITC

Selectividad de Filtros Sobreposición de imágenes

Selectividad de Filtros DAPI

Selectividad de Filtros FITC

Selectividad de Filtros TRITC

Selectividad de Filtros Sobre-posicio-namiento Multi-Focus!

Sistemas de Filtros de banda Dual/Triple CFP / YFP / DsRed Hela cell, tripleband CFP / YFP / DsRed Hela cell, singleband overlay (mFIP, SIS) + Visión completa + no requiere cambio de filtro (tiempo real) + desplazamiento de píxel cero ± colores mezclados - Pérdida de intensidad comparada con filtros de una sola banda

Equipo Necesario Lentes Objetivos Plan Apo 20x/0.60 Plan Fluar 20x/0.50 Plan 20x/0.40 No existe conexión directa entre lentes de fluorita y fluorescencia Fluorita viene de CaF2, un mineral usado antiguamente para fabricar objetivos de gran apertura numérica La Apertura Numérica es más importante que la corrección de curvatura Se pueden usar objetivos de contraste de fases pero no es recomendable porque reducen entre un 15 - 20% de intensidad

Gracias por prestar atención!!! FIN Gracias por prestar atención!!!