BIOQUÍMICA Enzimología

Enzimología Generalidades. Clasificación. Modo de acción de las enzimas. Cinética de las reacciones simples catalizadas por enzimas. Ecuación de Michaelis-Menten. Actividad enzimática. Unidades. Cuantificación de la actividad enzimática. Coenzimas. Factores que afectan la cinética enzimática. Inhibidores enzimáticos. Regulación de la catálisis enzimática.

Las enzimas son proteínas altamente especializadas que tienen como función la catálisis o regulación de la velocidad de las reacciones químicas que se llevan a cabo en los seres vivos. E + P E + S [ES]

Las enzimas son proteínas* que catalizan reacciones químicas No hacen factibles las reacciones imposibles Son sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH. Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas. * En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)

Aspectos generales de las enzimas Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa sobre un único sustrato o un grupo muy reducido de ellos. Sustrato: sustancia sobre la que actúa la enzima

Formación de productos Reacción catalizada por una enzima: centro activo región concreta de la enzima donde el sustrato se une Enzima y su sustrato Unión al centro activo Formación de productos E + S  ES  E + P Complejo enzima-sustrato

El centro activo comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y un sitio catalítico, formado por los aminoácidos directamente implicados en el mecanismo de la reacción

El sustrato se une a la enzima luego se inicia la catálisis Sitio de unión: es el que le da la especificidad a la enzima Sitio catalítico

Nomenclatura Hay varias formas de nombrar una enzima: nombres particulares nombre sistemático código de la comisión enzimática (enzyme comission)

Nomenclatura: nombres particulares Antiguamente, los enzimas recibían nombres particulares, asignados por su descubridor. Ejemplos: amilasa (hidrolisa el almidón) glucoquinasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP Al ir aumentando el número de enzimas conocidos, se hizo necesaria una nomenclatura sistemática que informara sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba.

Nomenclatura: nombre sistemático Consta actualmente de 3 partes: el sustrato preferente el tipo de reacción realizado terminación "asa" ejemplo: la glucoquinasa ATP:glucosa fosfo transferasa Glc + ATP  Glc-6P + ADP

Nomenclatura: Comisión de Enzimas El nombre es identificado por un código numérico: encabezado por las letras EC (enzyme commission) seguidas de cuatro números separados por puntos. el primer número indica a cual de las seis clases pertenece la enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos específicos que intervienen en la reacción.

Nomenclatura: Comisión de Enzimas Ej.: la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa) Glc + ATP  Glc-6P + ADP EC 2.7.1.2. 2: transferasa 7: fosfotransferasa 1: el aceptor es un grupo OH 2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato.

Nomenclatura: Comisión de Enzimas Clases Óxido-reductasas Transferasas Hidrolasas Liasas Isomerasas Ligasas

MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía de activación Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que disminuyen la Ea aún más que los catalizadores inorgánicos. Por ej, la descomposición del agua oxigenada (H2O2) puede ocurrir sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol con una enzima específico (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción 20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000 veces.

MODO DE ACCIÓN DE LAS ENZIMAS Hay dos modelos sobre la forma en que el sustrato se une al centro activo del enzima: el modelo llave-cerradura el modelo del ajuste inducido

MODELO LLAVE-CERRADURA La estructura del sustrato y la del centro activo son complementarias Este modelo es válido en muchos casos, pero no es siempre correcto

MODELO DEL AJUSTE INDUCIDO el centro activo adopta la conformación idónea sólo en presencia del sustrato. La unión del sustrato al centro activo del enzima desencadena un cambio conformacional que da lugar a la formación del producto.

Modelo del Ajuste Inducido

Cofactores - Coenzimas A veces, un enzima requiere para su función la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catálisis: los cofactores. Pueden ser iones inorgánicos como el Fe++, Mg++, Mn++, Zn++ etc. Casi un tercio de los enzimas conocidos requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molécula orgánica se llama coenzima.

Cofactores - Coenzimas Muchas de estas coenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente al enzima se llaman grupos prostéticos. La forma catalíticamente activa del enzima, es decir, el enzima unida a su grupo prostético, se llama holoenzima. La parte proteica de un holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: apoenzima + grupo prostético= holoenzima

Coenzima: NAD+ Deriva de la Vitamina B5 (ácido nicotínico)

Coenzima: FAD Es grupo prostético Deriva de la Vitamina B2 (flavina) FAD forma oxidada FADH2 forma reducida

CINÉTICA ENZIMÁTICA La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima puede medirse con relativa facilidad, ya que en muchos casos no es necesario purificar o aislar la enzima. Estos estudios proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la especifidad de la enzima.

CINÉTICA ENZIMÁTICA MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN Los estudios sistemáticos del efecto de la concentración inicial del sustrato sobre la actividad enzimática comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catálisis enzimática. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten desarrollaron esta teoría y propusieron una ecuación de velocidad que explica el comportamiento cinético de los enzimas.

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN v = v3 = k3 [ES] = V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA = v3 = k3 [ES] =             V = velocidad de la reacción catalizada por la enzima

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN CÁLCULO DE LA KM Y DE LA Vmax DE UN ENZIMA = v3 = k3 [ES] =             La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten es una hipérbola . La Vmax corresponde al valor máximo al que tiende la curva experimental, y la KM corresponde a la concentración de sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la Vmax.

El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: La constante de Michaelis-Menten (KM) es un parámetro cinético importante por varias razones: KM es la concentración de sustrato para la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: a menor KM, mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten. Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con las enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

Factores que afectan la cinética enzimática La actividad puede estar afectada por: el pH la temperatura la fuerza iónica Inhibidores

La mayoría de los enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Como ligeros cambios del pH pueden provocar la desnaturalización de la proteína, los seres vivos han desarrollado sistemas más o menos complejos para mantener estable el pH intracelular Efecto el pH

Efecto de la Temperatura

Factores que afectan la cinética enzimática: INHIBIDORES Ciertas moléculas pueden inhibir la acción catalítica de un enzima: son los inhibidores. Irreversibles E + I  EI se unen fuertemente a la E y el complejo no se disocia Reversibles E + I ⇄ EI

Inhibidores Reversibles Pueden actuar de 3 modos: ocupan temporalmente el centro activo por semejanza estructural con el sustrato original: inhibidor competitivo alteran la conformación espacial del enzima, impidiendo su unión al sustrato: inhibidor no competitivo Se unen al complejo E-S impidiendo la catálisis del sustrato: inhibidor acompetitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor competitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor no competitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

Inhibidores Reversibles inhibidor acompetitivo

Regulación de la catálisis enzimática las concentraciones del sustrato y de los productos finales presencia de inhibidores modulación alostérica modificación covalente activación por proteolisis (zimógenos) isoenzimas

MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Hay enzimas que pueden adoptar 2 conformaciones interconvertibles llamadas R (relajada) y T (tensa). R es la forma más activa porque se une al sustrato con más afinidad. Las formas R y T se encuentran en equilibrio R <==> T

MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Ciertas sustancias tienden a estabilizar la forma R. Son los llamados moduladores positivos. El propio sustrato es a menudo un modulador positivo. Las moléculas que favorecen la forma R pero que actúan sobre una región del enzima distinta del centro activo son los activadores alostéricos (modulador alostérico positivo)

MODULACIÓN ALOSTÉRICA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Las sustancias que favorecen la forma T y actúan en lugares distintos del centro activo de la enzima y disminuyen la actividad enzimática: son los moduladores alostéricos negativos.

Regulación de la actividad enzimática por MODIFICACIÓN COVALENTE Hay enzimas que pasan de la forma inactiva a la activa uniéndose covalentemente a un grupo químico de pequeño tamaño como el Pi o el AMP. También se da el caso inverso El enzima no fosforilado es inactivo El enzima fosforilado es activo

Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA Algunos enzimas no se sintetizan como tales, sino como proteínas precursoras sin actividad enzimática. Estas proteínas se llaman proenzimas o zimógenos. Para activarse, los zimógenos sufren un ataque hidrolítico que origina la liberación de uno o varios péptidos. El resto de la molécula proteica adopta la conformación y las propiedades del enzima activo. Ej.: enzimas digestivos se secretan en forma de zimógenos y en el tubo digestivo se convierten en la forma activa. Es el caso de la quimotripsina, que se sintetiza en forma de quimotripsinógeno

Regulación de la actividad enzimática por ACTIVACIÓN PROTEOLÍTICA

REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA POR MEDIO DE ISOENZIMAS Algunos enzimas tienen distinta estructura molecular aunque su función biológica es similar. Se llaman isozimas o isoenzimas. Estas diferencias de estructura se traducen en ligeros cambios en sus propiedades, de forma que cada isozima se adapta perfectamente a la función que debe realizar. Así, podemos observar la existencia de isoenzimas en función de: el tipo de tejido: Por ejemplo, la lactato deshidrogenasa presenta isozimas distintos en músculo y corazón. el compartimento celular donde actúa: Por ejemplo, la malato deshidrogenasa del citoplasma es distinta de la de la mitocondria. el momento concreto del desarrollo del individuo. Ej: algunos enzimas de la glicolisis del feto son diferentes de los mismos enzimas en el adulto.