ENSAYOS DE RESTRICCIÓN DE PLÁSMIDOS BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL EQUIPO: 4 FACULTAD DE QUÍMICA, UNAM

OBJETIVOS Conocer el principio de separación y detección de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Emplear la electroforesis en geles de agarosa para visualizar ácidos nucleicos. Determinar el tamaño de fragmentos de ácidos separados en geles de agarosa Conocer la utilidad de las enzimas de restricción en la transformación genética y la biotecnología.

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Nacimiento de la ingeniería genética. Reconoce y corta secuencias de bases especificas en el DNA . Protegen a procariontes de DNA extraño. Existen tres tipos: I, II y III. Más importante las tipo II. Cortan de 4 a 8 pares de bases. cortan sobre la secuencia que reconocen y NO tienen actividad de metilasas de DNA

Enzimas de Restricción Las endonucleasas se denominan enzimas de restricción, debido a que es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión por virus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.

Las enzimas de restricción reconocen secuencias palindrómicas Palíndrome. segmentos de DNA que se leen igual de derecha a izquierda que de izquierda a derecha. Las primeras 3 letras de la enzima se refieren a las iniciales del nombre científico de la bacteria de donde se aisló y se escribe en itálicas. Por ejemplo, EcoRI se refiere a que la enzima proviene de Escherichia coli.

ROMOS

Formación del DNA recombinante

Electroforesis en gel: separación de las moléculas de DNA Una vez cortado el DNA se separa por electroforesis Los de menor tamaño corren más rápido. Gel de agarosa: especial para DNA Los fragmentos de DNA corren al positivo por los grupos fosfato Se tiñe con bromuro de etidio Se pueden purificar fragmentos de DNA del gel y utilizar.

Aplicaciones Reconocimiento de una determinada secuencia de DNA para detectar un polimorfismo Medicina legal; Técnica de hibridación de Southern donde la enzima mas usada es HaeIII Identificación de patógenos causante de enfermedades Adenovirus

La clonación en una bacteria de un fragmento de DNA Eliminación de secuencias genómicas Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

¿Qué vamos ha hacer en la práctica? 1. Usar células que fueron transformadas en la clase experimental

Células que contendrán: Vector de clonación o Vector vacío Sitio múltiple de clonación

Células transformantes con el Vector recombinante El gen de interés se inserto entre las secuencias que cortan las enzimas BamHI y NedI. Ambas enzimas producen extremos cohesivos y en el vector recombinante solo cortan 1 vez cada una

Desarrollo experimental Ensayo de restricción Etiquetar 2 tubos microfuga Colocar 10µL plásmido+1µL amortiguador Tango 10x Transferir hielo 5min. Añadir tubo 1: 1µL de BamHI o Ndel. Tubo 2: 1µL BamHI + 1µL Ndel. Incubar 37°C/1.5h Añadir 0.5µL de sln. RNAsa Colocar tubos en hielo Tomar alícuota 10µL o todo el ensayo para gel de agarosa Centrifugar 5 seg. Eliminar RNA (opcional) Incubar 100°C/5min

¿Qué esperamos? TRATAMIENTO No. de bandas o fragmentos de DNA Peso molecular esperado Plásmido sin digerir 1 * 6500 pb Plásmido digerido con 1 enzima de restricción 1 Plásmido digerido con 2 enzimas de restricción 2 5310 pb 1200 pb * Revisaremos los topoisomeros en la sección de corrimiento electroforético

Bibliografía Madigan Martinko, et al, Brock biología de los microorganismos, Pearson education, 2008, pp: 300-350. Tortora J. Gierard. Introducción a la microbiología, Ed Medica Panamericana, 2007 pp 256-257. http://uvigen.fcien.edu.uy/utem/herramgen/recomb.pdf. 12/10/11 8:40 am http://academic.uprm.edu/~jvelezg/Lab12.pdf. 12/10/11 8:41 am