PROCESAMIENTO DE IMÁGENES EN LABORATORIO Y PATOLOGIA Informática Médica Dra. Flora del Carmen Ojeda Ornelas Dr. Arnoldo Raul Esparza Dra. Sandra Berenice Raya Santoyo

Biometría Hemática

Cámara de Neubauer concentración en la suspensión (células / mL) = 10000 (x/4)

Cell Coulter Se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio.

Citometría de Flujo (CMF): Parámetros: Características intrínsecas Características antigénicas

Citometría de Flujo (CMF): De dispersión De fluorescencia Señales

Citometría de Flujo (CMF) Ventajas: Realiza múltiples marcajes Analiza hasta 5000 partículas/segundo Analiza intensidad antigénica Mayor sensibilidad y objetividad Permite almacenar información Desventajas: se pierde información sobre arquitectura de tejidos, interacción y medio que los rodea.

CITOMETRO COMPONENTES BÁSICOS: a)Sistema de fluidos: Inyección de muestra Cámara de flujo b) Sistema óptico Fuente de luz Detectores c) Sistemas electrónicos y de computación: Amplificador-convertidor Sistema informático

CITOMETRO

Citometro

Linfocitos (rojo) Monocitos (verde) Neutrófilos (azul) Eosinófilos (amarillo) Basófilos CITOGRAMA:

CITOGRAMA: Hematíes (rojo) Plaquetas (verde)

CULTIVOS Conteo automático de colonias microbianas utilizando técnicas de procesamiento de imágenes (COVASIAM)

Cultivos: Utilizados para observar el crecimiento microbiano Métodos para cuantificación de células: Directos Indirectos

Componentes de COVASIAM:

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae

Equipos Automatizados para Exámenes de laboratorio Espectrofotometría: QS, Proteínas séricas Nefelometría: Pruebas Inmunológicas. Quimioluminiscencia: Hormonas. Radioinmunoanálisis (RIA): Hormonas. Citometría de flujo: BHC, celularidad. Fluorescencia: Tejidos (biopsia) Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): carga viral, hepatitis, VIH, DNA.

Exámenes de Laboratorio Tipo de Prueba. Utilidad. Tipo de Reacción. Mecanismos de acción o fundamento. Medición: equipo, consideraciones especiales. Imágenes.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Tipo de Reacción: MOLECULAR Fundamento y mecanismo de acción: El DNA sufre 3 procesos: Alineación Desnaturalización Amplificación. Para su interpretación requiere de electroforesis de proteínas.

Radioinmunoanálisis (RIA) Utilidad: Determinación de HORMONAS. Tipo de Reacción: Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac). Fundamento: Marcaje con radioisótopo Medición: Contador gamma (en pg). NOTA: actualmente casi en desuso, ha sido sustituido por Quimioluminiscencia.

Inmunofluorescencia Directa Usos: Tejidos obtenidos por Biopsia. Tipo de Reacción: Ag-Ac Fudamento: El Ag es el tejido del paciente El Ac se selecciona en base a lo que buscamos y se marca con un flurocromo (fluoresceína, rodamina, etc.). Luego se realiza la selección del filtro. Medición: Microscopio de epifluorescencia

Inmunofluorescencia Indirecta Utiliza un sustrato (comercial): Ejemplo ANA-Hep2 . Tipo de Reacción: Ac-Ac* Fundamento: El Ac es el suero del paciente y el Ac* es el anticuerpo seleccionado marcado con un fluorocromo Medición: se selecciona el filtro y se utiliza el microscopio de epifluorescencia: Si Fluorece= (+), No fluorece= Negativo(-)

Citometría de Flujo Utilidad: BHC, celularidad y subpoblación. Tipo de Reacción: Morfología celular. Funamento: el rayo láser al atravesar las Células, permite determinar forma, tamaño, volumen, conductividad y dispersión de luz. Medición: Citómetro.

Citometro

Espectrofotometría Utilidad: Química sanguínea, Proteínas séricas. Tipo de Reacción: Hay 2 tipos: Reacción química y Reacción enzimática (ELISA). Fundamento: Absorción de luz . Medición: Espectrofotómetro.

Nefelometría Utilidad: Pruebas inmunológicas (IgG, A, M, complemento, PCR, etc.). Tipo de Reacción: Ag-Ac Fundamento: Sustrato quimioluminiscente Medición: mide saltos de energía. Se utiliza un Luminómetro.

Quimioluminiscencia Utilidad: Hormonas (FSH, LH, Tiroideas, etc.), TORCH. Tipo de Reacción: Ag-Ac Fundamento: Sustrato quimioluminiscente Medición: Mide saltos de energía (fg). Fotodetectores, contadores de centelleo líquido, sistemas de detección fotográficos y de imágenes. Lo más actual Quimioluminiscencia Amplificada.

Quimioluminsencia

Espectrofotometría Método de análisis óptico más usado. El Espectrofotómetro permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia. Todas las sustancias pueden absorber energía radiante. Ej. Agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.

Espectometro Enzimático

Espectrofotómetro Instrumento que tiene la capacidad de manejar un haz de radiación electromagnética (REM), comúnmente denominado luz, separándolo en facilitar la identificación, calificación y cuantificación de energía. El color de las sustancias se debe a que éstas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas, y sólo vemos aquellas longitudes de onda que no fueron absorbidas.

Componentes Espectrofotómetro Fuente de luz: lámpara de tungsteno y arco de xenón. Ilumina la muestra. Rendija de entrada: impide que la luz dispersa entre en el sistema de selección de longitud de onda. Monocromador: pueden ser prismas o redes de difracción. Rendija de salida: impide que la luz difusa atraviese la cubeta. Cubeta: recipiente donde se coloca la muestra. Fotodetectores: para recibir la señal en forma simultánea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Fotocélulas (lámina de cobre).

Espectrofotómetro Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Mide la Absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (I) y graficar estos valores en función del largo de onda, formando un espectrograma. Algunos electrones de los átomos que forman las moléculas, absorben energía entrando a un estado alterado. Al recuperarse, la energía absorbida en emitida en forma de fotones.

Espectometro QS

Espectrofotómetro Nos dice la cantidad de la muestra: La concentración es proporcional a la absorbancia, según la Ley Beer-Lambert, donde a mayor cantidad de moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus electrones. Abs= K C L K= coeficiente de extinción molar. C= concentración, L= distancia que viaja la luz a través de la muestra (normalmente es de 1 cm)

Espectrofotómetro La cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje (%) de tramitancia, donde %T= - Log Abs El instrumento necesita “blanquear” el aparato antes de cada lectura, colocando una cubeta con una solución control que tenga todos los componentes de la reacción, menos la sustancia que va a ser medida y ajustando la lectura a cero absorbancia. Todas las moléculas presentan absorbancia.

Espectometro QS

Nefelometría: Principios Cuando un haz de luz choca contra una partícula en suspención, sufre una serie de fenómenos: dispersión de la luz, reflexión, absorción y transmisión. En este caso es la dispersión lo que se mide, y ésta depende de: tamaño y peso molecular de las partículas, longitud de onda de luz incidente, distancia del detector a la cubeta y concentración de partículas. Se relacionan mediante fórmulas matemáticas basadas en la Ley de Rayleigh.

Nefelometría Es la medida de la luz dispersada en ángulos distintos al de la incidencia. Lo más frecuente es que sea entre 15°-19° El instrumental incluye: Fuente de luz (energía radiante), Colimador (lente o espejo), Monocromador (filtros, , prismas, redes de difracción), Cubeta= espectrofotometría y Sistema de detección

Nefelometro

Quimioluminiscencia Fenómeno de emisión de radiación electromagnética, ultravioleta o visible, que se observa cuando una especia electrónicamente excitada, producida por una reacción química a temperatura amiente, regresa a su estado basal. Factores que afectan la emisión: estructura química, naturaleza y concentración del sustrato, naturaleza del catalizador, iones metálicos, pH, hidrofobicidad del disolvente.

Quimioluminiscencia Sistemas de detección: fotodetectores, contadores de centelleo líquido, sistemas de detección fotográficos y de imágenes. Aplicaciones analíticas: análisis volumétrico, detección de cromatografía de gases, inmovilización de reactivos de sistemas de flujo, sistemas de inyección de flujo y sensores quimioluminiscentes.

Evolución de la tecnología de Inmunoanálisis Radioinmunoanálisis (RIA). ELISA ELFA (ELISA + Fluorescencia) Quimioluminiscencia Electroquimioluminiscencia Quimioluminiscencia Amplificada: peroxidasa de rábano para marcaje, luminol es el sustrato.

Quimioluminiscencia Amplificada Prolonga el tiempo de emisión de luz Aumenta la sensibilidad Aumenta la especificidad Reduce la lectura de Blandos y ruido de fondo. El amplificador (acetanilida) actúa como catalizador y aumenta 1000 veces la velocidad de oxidación del luminol.

Equipo de Quimiluminisencia

Pantalla equipo de Quimioluminisencia

Quimioluminisencia

Citometro

Espectometro base

Quimioluminisencia

INFORMATICA EN PATOLOGIA

Imagen en Patología (Anatomía Patológica) Imagen macroscópica: biopsias, piezas quirúrgicas. Imagen microscópica: Cortes histológicos (biopsias, bloques celulares, autopsias). Tinciones y técnicas especiales. Citologías. Tinciones y técnicas especiales. Patología molecular: FISH, Geles agarosa, GCH Principales problemas: Archivo (espacio) y gestión deficiente (búsquedas)

Calidad de Imagen

Telepatología Estática o “almacenar y enviar”: Sistemas no robotizados (ej: e-mail) que envían imágenes fijas adquiridas antes de la sesión. Preparaciones virtuales: imagen digital de toda la preparación. Dinámica: Transmisión de información en tiempo real.

Telepatología Estática o “almacenar y enviar”. Pasiva: Sin interacción activa con el sistema de imágenes. Correo electrónico: envío de imágenes como ficheros adjuntos. Documentos HTML: las imágenes se publican en páginas web. FTP: envío de los ficheros a un servidor Interactiva: Consulta en directo con unas imágenes preseleccionadas Teléfono Programa de chat, teleconferencia o compartir aplicaciones

VENTAJAS DE PREPARACIÓN VIRTUAL Cortes histológicos Las preparaciones convencionales son frágiles, No son permanentes, sobre todo inmunofluorescencia, cristales articulación, … En citología, no es posible distribuir copias. VENTAJAS DE PREPARACIÓN VIRTUAL Pequeños aumentos con calidad extraordinaria. Mapa dinámico de preparación Enviar imágenes de mayor resolución recibiendo sólo el área seleccionada. Grabar y reproducir la trayectoria seguida por el patólogo durante su examen de la preparación o laminilla y Las imágenes quedan almacenadas permanentemente, y sobre ellas es posible realizar anotaciones que también pueden quedar grabadas. Área de tejido de unos 25 x 20 mm

Qué es físicamente una preparación virtual Un directorio con un conjunto de ficheros imágenes, a menudo JPEG, y un fichero de coordenadas, que contiene la información sobre cómo reconstruir la preparación completa Un único fichero JPEG 2000 o TIFF multirresolución, que a su vez contiene información sobre la preparación (número de biopsia o citología recogida en el código de barras, fecha de creación, parámetros de iluminación, etc.)

Ventajas de preparaciones virtuales Hoy día las preparaciones virtuales ayudan a Crear archivos digitales: Casos de interés docente, asistencial, investigación, gestión de calidad o riesgos Mejor comunicación entre patólogos (segunda opinión) Diagnóstico primario: Centros remotos con uno o ningún patólogo Gestión del conocimiento: Anotaciones (marca área de interés), análisis de imagen, integración con sistemas de información. Protocolos de investigación.

SISTEMA DE OBTENCION

Ejemplos de servicios DICOM Modalidad TAC Archivo PACS SCU Almacenamiento SCP Almacenamiento Modalidad Virtual Slide Archivo PACS SCU Almacenamiento SCP Almacenamiento

Universidades de Tampere y Helsinki

Telepatología HOSPITAL B HOSPITAL A Remitente Segunda opinión Padded envelope

Common image viewer

Ayuda al diagnóstico

Análisis automatizado de imagen Cuantificación IHQ Fluorescencia (FISH) TMA Reconstrucción 3D Productos: Virtual slides (Mirax, Scanscope, Nanozoomer) Software: analySIS, Definiens, BioImagene,… Cuantificar marcadores inmunohistoquímicos y de FISH: Applied Imaging Ariol (Olympus Optical España) Dako ACIS III Ayuda al cribado citológico: CyTyc ThinPrep Imaging System FDA Clearance for Her2/neu Application on Pathiam™ Imaging Software

Conclusiones La microscopía digital es un componente esencial en la implantación de las nuevas tecnologías en Patología. La imagen digital permite utilizar herramientas de ayuda al diagnóstico Es posible integrar la imagen de Patología con otros sistemas de información (SIAP, HIS, PACS). Tiene impacto asistencial favorable en teleconsulta o segunda opinión. Facilita la gestión de programas de calidad . En la formación médica continua es donde los patólogos se encuentra más cómodos utilizando preparaciones virtuales Las redes de telepatología basadas en estándares pueden interconectarse entre sí. In conclusion, we think that nowadays, virtual slides can play an important rule in teleconsultation, quality assurance, and continuing medical education. But still and important effort is needed to get an integrated view of all the different technological actors in Pathology.