METABOLISMO, NUTRICIÓN Y CRECIMIENTO BACTERIANO B.C. Rogelio D. González.

Introducción ¿Qué utilidad tiene conocer las condiciones que un microorganismos requiere para crecer? # Obtenerlo en el laboratorio Cultivo # Combatirlo o evitar su proliferación

Introducción 80 % de agua 20 % de peso seco: Proteínas Ácidos Nucleicos Polisacáridos Lípidos Peptidoglucano Otros compuestos de peso molecular mas bajo

Indudablemente es necesario que el ambiente en el que se encuentren las células sea natural o artificial, pueda brindarles esas sustancias y la energía necesarias para que se produzcan las reacciones.

Introducción Biosíntesis: Ingreso de substancias para transformarse en compuestos estructurales

FISIOLOGÍA BACTERIANA cómo los diferentes componentes químicos y estructuras bacterianas se interrelacionan tanto entre sí como con el medio que las rodea para poder sobrevivir y desarrollarse. La replicación de una bacteria implica: metabolismo bacteriano regulación y coordinación de los procesos metabólicos la división celular

Nutrientes Substancias necesarias para asegurar supervivencia. Proveen energía y elementos necesarios para síntesis de estructuras celulares. Ingreso por absorción. Viabilidad: capacidad de reproducción.

Nutrientes esenciales o Básicos Asimilables por simple difusión o por transporte activo Agua Fuentes de Carbono Compuestos de nitrógeno Fósforo (fosfatos inorgánicos)

Factores: Factores de crecimientos o Factores orgánicos: sustancias que las células no pueden sintetizar y comprenden vitaminas y algunos AA. Ej: vitaminas del complejo B. Factor X (hemina) y Factor V (NAD) son indispensables para H. influenzae Factores estimulantes: son los que influyen en el proceso de crecimiento de las bacterias, aunque no imprescindibles, pero el proceso es más rápido y mejor en presencia de ellos.

Otros nutrientes Iones potasio Iones Magnesio Factores de Crecimiento u orgánicos Vitaminas Aminoácidos Oligoelementos Hierro Cobre Cobalto

Factores Estimulantes Influyen en el proceso de crecimiento. No son imprescindibles. En presencia de factores estimulantes crecen mas rápido y mejor.

Metabolismo bacteriano: es la suma de todas las reacciones químicas que tienen lugar en la célula, pueden dividirse en catabolismo y anabolismo En el catabolismo se reduce la complejidad de las moléculas y se libera energía libre. En el anabolismo se requiere el uso de energía libre para aumentar la complejidad de las moléculas (son reacciones de biosíntesis) Las bacterias, llevan a cabo todos los procesos metabólicos gracias a las enzimas.

Reacciones anabólicas y catabólicas

Enzimas Catalizadores orgánicos que aceleran las reacciones químicas por su presencia, controlados genéticamente Actúan sobre un sustrato Reciben su nombre por el sustrato sobre el que actúan (Lipasa = actúa sobre lípidos) Enzimas de la respiración : deshidrogenasas y oxidasas Proteínas de gran tamaño Proteínas mas fracción no proteica (cofactor)

Enzimas : son catalizadores orgánicos que actúan por presencia y aceleran la reacción. Son específicas dadas que actúan sobre un sustrato, reciben el nombre de ese sustrato más terminación ASA.

Enzima Holoenzima: proteína (apoenzima) mas cofactor Coenzima : el cofactor es ion metalico o molecula orgánica compleja Grupo prostetico: cofactor unido fuertemente a apoenzima Constitutivas: preformadas en la célula Inducibles o adaptativas: se forma en condiciones ambientales especiales o en presencia de sustratos apropiados

Enzimas Endoenzimas: biosintesis para formar macromoléculas (Anabolismo) Mecanismos de Represión Vías anfibólicas: los productos generados en la degradación de un elemento se aprovechan en la síntesis de otros

Enzimas Exoenzimas de tipo hidrolítico: unión de agua a macromoléculas, unidades pequeñas (bloques estructurales. Facilitan penetración pasiva, facilitada o activa a través de pared y membrana Para ingreso activo: actividad de permeasas

Enzimas

Transporte de nutrientes: Estos ingresan en las células por absorción, no por ingestión. Los nutrientes deben ser transportados dentro de la célula en una forma soluble. La velocidad del transporte sigue la cinética descripta por Michaelis- Menten (ecuación para las reacciones enzimáticas).

Las bacterias pueden usar 4 tipos diferentes de transporte de los sustratos: difusión facilitada transporte activo translocación de sustratos difusión pasiva

Categorías nutritivas: Según la fuente de Carbono son autótrofas o litótrofas (CO2) y en el otro grupo heterótrofas u organótrofas (C orgánico). De acuerdo con el origen de la Energía son fotótrofas (captan la luz o Energía radiante) y quimiótrofas (obtienen energía a partir de reacciones químicas, del ATP)

Combinando estas dos situaciones, fuente de C y de Energía se pueden categorizar según sus requerimientos nutritivos en: FOTOAUTÓTROFOS: requieren luz para su energía (fotosintéticos) y CO2. FOTOHETERÓTROFOS: Energía lumínica, pero incorporan C orgánico (alcoholes, ácidos grasos e hidratos de C) QUIMIOAUTÓTROFOS: Energía de reacciones químicas, pero incorporan C a partir del CO2. QUIMIOHETERÓTROFOS: Casi todos los microorganismos patógenos para el ser humano. Energía por reacciones químicas, el C proviene de compuestos orgánicos (glucosa es el más utilizado)

Categorías Nutritivas

Producción de energía La glucosa es una molécula reducida; que durante la oxidación celular se libera energía. La energía liberada puede ser captada para formar ATP. Las vías metabólicas de producción de energía son una serie de reacciones químicas catalizadas por enzimas que permiten el almacenamiento de energía en moléculas orgánicas y la liberación de energía desde estas moléculas

Vías metabólicas mas conocidas Glucólisis Como consecuencia del metabolismo hay producción de toxinas, vitaminas, antibióticos, compuestos de interés industrial (alcoholes)

Catabolismo de hidratos de carbono La mayor parte de la energía de una célula deriva de la oxidación de los hidratos de carbono. Los dos tipos principales son la respiración celular y la fermentación.

Respiración celular aerobia y anaerobia En los procariontes aeróbicos la oxidación completa de una molécula de glucosa mediante la glucólisis, el ciclo de Krebs y la cadena transportadora de electrones. En la respiración anaerobia los aceptores finales comprenden NO3- SO4-2 Y CO3-2

FERMENTACIÓN Libera energía a partir de azúcares u otras moléculas orgánicas por oxidación. No necesita O2 Se forma ácido láctico o etanol

Vías metabólicas mas conocidas

Catabolismo de lípidos y proteínas Las lipasas hidrolizan lípidos para formar glicerol y ácidos grasos Para poder ser catabolizados los aminoácidos se deben convertir en distintos compuestos que ingresen en el cíclo de Krebs.

Pruebas de bioquímicas de identificación Se utilizan con frecuencia para la identificar bacterias y levaduras porque las diferentes especies producen distintas enzimas. Ej Enzimas catalizadoras de aminoácidos, pruebas de fermentación

Requerimientos para el crecimiento Requerimientos físicos Temperatura pH Presión osmótica Requerimientos químicos Nutrientes Factores de crecimiento

Efecto de la Temperatura Temperatura mínima de crecimiento Temperatura óptima de crecimiento Temperatura máxima de crecimiento

Sicrófilos Requieren bajas temperaturas 15 – 20 ºC La mínima puede ser muy baja Bacterias en el fondo del mar y en los polos

Mesófilos Rango de temperaturas: 25 – 40 ºC Temperatura óptima: 37 ºC ± 1 ºC Agentes que afectan al hombre y los animales

Termófilos Toleran altas temperaturas Temperatura óptima: 55 ºC Temperatura máxima: 80 ºC o mas.

Condiciones de pH pH : Potencial Hidrógeno. Va desde 0 a 14. pH < 6,5 ácido pH > 7,5 básico o alcalino pH 6,5 – 7,5 neutro Mas adecuado para crecimiento bacteriano Bacterias que crecen hasta pH 4 Acidófilas (Por ejemplo: Lactobacillus) Vibrio cholerae : medio alcalino

Presión Osmótica Los solutos (sales y azúcares) disueltos se desplazan a zonas de menor concentración. El agua se desplaza a zonas de mayor concentración de solutos Una presión osmótica alta causa pérdida de agua y plasmólisis de la célula Halófilas: bacterias que toleran altas concentraciones salinas Halófilas facultativas : toleran hasta un 2 % de sales

Condiciones atmósféricas Potencial de óxido-reducción o Redox (Eh) Respiración bacteriana : reacciones de óxido- reducción, en cadena El aceptor final de electrones o hidrogeniones es variable

Aerobios Requieren oxígeno, aceptor final de hidrógeno Formación de H2O y CO2 Producción de enzima Catalasa : desdoblamiento del Peróxido de hidrógeno (H2O2) en H2O y oxígeno Prueba de Catalasa para diferenciar microroganismos (Staphylococcus de Streptococcus)

Anaerobios Viven en ausencia de oxígeno atmosférico Aceptor final : compuesto inorgánico (NO3 o SO4) Fermentación: la fuente de carbono provee energía, el donador de hidrógeno y el aceptor final (un compuesto orgánico como ácidos o alcoholes) Muy frecuente en microorganismos orales

Anaerobios Anaerobios obligados: no utilizan O2 Anaerobios moderados: toleran de un 2 a un 8 % de O2 Anaerobios aerotolerantes: sobreviven un tiempo en presencia de O2 Anaerobios facultativos: aceptan indistintintamente una situación u otra

Microaerófilos Requieren bajas concentraciones de O2 para crecer Utilizan el O2 como fuente de energía pero a concentraciones < 15 % Susceptibles a radicales superóxido Enzima Superóxido Dismutasa (SOD) : transforma radicales superóxido en H2O2 Capnofilas: desarrollan mejor con concentraciones de CO2 elevadas

Medios de Cultivo Substancias nutritivas que permiten el desarrollo de microorganismos en el laboratorio Cultivo: brindar condiciones óptimas de crecimiento Fáciles de preparar Baratos Permitir el desarrollo de gran variedad de gérmenes Aportar nutrientes adecuados (aminoacidos, nucleótidos, factores de crecimiento, glucosa, iones inorganicos)

Medios de Cultivo Optimo contenido de H2O y correcto pH Requerimientos de O2 Estéril, evitar contaminaciones Incubación: temperatura óptima en estufas

Medios de cultivo químicamente definidos Es uno de los cuales se conoce la composición química exacta. Suelen reservarse para el trabajo experimental o para el crecimiento de bacterias autótrofas

Medios complejos Se cultivan de modo sistemático a las bacterias heterótrofas y los hongos en los medios de cultivo complejos Agar nutritivo Caldo nutritivo

Clasificación de los medios de cultivo Naturales: solo usados para enriquecer medios (leche, suero, papa) Artificiales se preparan en el laboratorio Líquidos: caldos Sólidos: caldos adicionados de substancias capaces de solidificar (Agar- agar) Medios Complejos: extractos de carne, levadura, peptonas. Medios Enriquecidos: agregado de suero o sangre

Clasificación de los medios de cultivo Medios selectivos: permiten crecer un solo tipo de microorganismo (substancias inhibidoras) Medios diferenciales o indicadores: evidencia alguna actividad metabólica por cambio de estado o color propia de un tipo determinado de microorganismo Medios de Transporte: traslado de muestras biológicas manteniendo las bacterias viables Medios de enriquecimiento: proporciona nutrientes y condiciones ambientales para favorecer el desarrollo de un microbio particular pero no el de otros.

Crecimiento Bacteriano Aumento de número (no de tamaño) Multiplicación bacteriana: fisión simple o binaria Elongación Auto duplicación de ADN cromosómico Tabicado central Invaginación membrana celular Síntesis de pared

Tiempo de generación Tiempo necesario para la duplicación celular Distintiva de cada especie Puede influirse por factores estimulantes Varían de 20 minutos (Escherichia coli) hasta 24 horas

Curva de Crecimiento Bacteriano Bacteria en medio adecuado Gráfico de coordenadas: número de bacterias (logaritmo) versus lapso de tiempo. Distinta para cada bacteria En todas se identifican cuatro etapas

Fase de Latencia El número de microorganismos no varía Adaptación al medio, producción de enzimas Tiempo variable: entre una hora a días. Tamaño relativo aumentado por división

Fase exponencial o de crecimiento logarítmico Relación casi lineal entre el tiempo y el número de elementos. Actividad metabólica incrementada Depende del tiempo de generación de cada bacteria Los antimicrobianos son mas activos Puede haber variaciones entre el crecimiento in vitro e in vivo.

Fase Estacionaria En determinado punto el crecimiento disminuye La población no aumenta Células nuevas reemplazan a las células muertas Actividad metabólica mas lenta Células en animación suspendida Producción de metabolitos secundarios Antibioticos Toxinas Fase de Esporogenesis para las especies productoras de esporas

Fase de declinación o muerte Recuento de células disminuye sensiblemente El numero de células muertas supera al número de células vivas Acumulación de productos tóxicos Disminución de nutrientes Aparición rápida : autolimitar diseminación infecciones

Técnicas para determinar el número y viabilidad de las células Contar al microscopio el número de células en un volumen conocido Establecer el número de células por turbidimetria Recuento de elementos viables por cultivo (Unidad Formadora de Colonias o UFC)

Recuento en placa Diluciones seriadas Placa vertida Diseminación en placas

CONTEO DE CÉLULAS VIABLES MÉTODO DE EXTENDIDO EN PLACA Es el método de elección para anaerobios facultativos y cultivo de microaerófilos.

CONTEO DE CÉLULAS VIABLES MÉTODO DE VERTIDO EN PLACA. Esta técnica se usa generalmente para bacterias aerobias obligatorias.

CONTEO DE CÉLULAS VIABLES Útil para la técnica de vertido en placa o extensión en placa. Se siembran volúmenes conocidos de cada dilución Luego se incuba a 35 – 37 0C durante 24 – 48 horas.

Otros métodos Directos Filtración Método del número más probable Recuento microscópico directo

Métodos indirectos Turbidimetría Actividad metabólica Peso seco

Gracias…………………