DNA MITOCONDRIAL EN NÚCLEOS DE HEPATOCITOS DE RATA OBSERVADO CON FISH Mónica González-Sánchez, María J Puertas, Miriam González-García Dpto. de Genética Facultad de Biología Universidad Complutense de Madrid

Introducción ▪En el núcleo eucariota existen secuencias homólogas al DNAmt Teoría endosimbiótica (L. Margulis, 1967) ▪Lough y col., 2008: El DNAmt se incorpora y se elimina del genoma de maíz de forma continua. ▪Las inserciones de DNAmt en el núcleo pueden están relacionadas con procesos neoplásicos y envejecimiento.

Introducción Objetivo: detectar mediante FISH la presencia de DNAmt en el núcleo de hepatocitos pertenecientes a ratas jóvenes y viejas. ▪Mozzhukhina y col, 1994: acumulación de secuencias de DNAmt en regiones activas en transcripción de DNA nuclear en hepatocitos de ratas viejas. ▪Shay y Werbin, 1992: 100 copias de DNAmt en células HeLa (10% en genes estructurales)

Jóvenes (4-5 meses) Viejas (35-36 meses) Perfusión con colagenasa (Romero y Viña, 1983) Gradiente de Percoll Hepatocitos inviables y otras células Hepatocitos viables Aislamiento de los hepatocitos Fijación en Formaldehído 4% Realización de las preparaciones

Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) Jóvenes Viejas (TTAGGG) n 2 ng/ml ADNmt Telómeros ADNmt Telómeros (TTAGGG) n 2 ng/ml Image J (National Institute of Health,

Tamaño e intensidad de los núcleos Jóvenes Viejas JóvenesViejos Nº núcleos analizados Área (µm2)218,5 + 5,8247,6 + 6,1*** Intensidad2 x ,4x10 6 2,7 x ,1x10 6 *** ROI Área en px 2 Intensidad ( )

Señales de ADNmt y teloméricas 0,38 µm ADNmt Telómeros ADNmt 0,38 µm Telómeros

Tamaño, intensidad y nº de señales de ADNmt ADNmt Volumen px 3 Área px 2 Coeficiente correlación= 0,992 Selección señales ADNmt

Tamaño, intensidad y nº de señales de ADNmt JóvenesViejos Señales ADNmt analizadas Área (µm2)0,88 + 0,021,00 + 0,02*** Intensidad *** JóvenesViejos Nº núcleos analizados Nº señales ADNmt/N13,65 + 0,313,69 + 0,3n.s.

Tamaño, intensidad y nº de señales teloméricas TelómerosSelección señales teloméricas

JóvenesViejos Nº núcleos analizados50103 Nº señales teloméricas/N39,3 + 2,0136,2 + 1,21n.s. JóvenesViejos Señales ADNmt analizadas Área (µm2)0,42 + 0,0090,43 + 0,007n.s. Intensidad n.s. Tamaño, intensidad y nº de señales teloméricas

Discusión ▪El DNAmt se inserta en lugares determinados del núcleo. ▪La cantidad de DNAmt en el núcleo aumenta con la edad. ▪El aumento de tamaño de las señales de DNAmt en los núcleos viejos no se debe a poliploidía o endorreduplicación. ▪El método de medida utilizado subestima en nº real de señales. ▪Otras secuencias de DNA nuclear pueden estar amplificándose. ▪¿ Amplificación del DNAmt presente en el núcleo o migración de secuencias desde la mitocondria?

Gustavo Barja Chechu Puertas Miriam González Mónica González José Gómez Facultad de Biología Universidad Complutense de Madrid Falta Pilar Caro Departamento de Fisiología Facultad de Farmacia Universitat de València Juán Sastre José Viña Alessandro Arduini Consuelo Borrás