Tecnología del ADN recombinante

A tres décadas de la primera planta transgénica Definir plásmido Definir DNA recombinante ¿Qué es un transgénico? Definir vectores Definir células recombinantes ¿Qué es la biolística y la electroporación? Explicar la formación de una planta transgénica ¿Para qué se utiliza la biotecnología? (Ingeniería genética)

ADN recombinante: es una molécula que proviene de la unión artificial de dos fragmentos de ADN (a menudo de especies diferentes) que se combinan in vitro en la misma molécula de DNA.

ADN Recombinante La tecnología de ADN recombinante es el conjunto de técnicas que permite aislar un gen de un organismo para su posterior manipulación e inserción en otro diferente. De ese modo podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria, hongo) o un virus produzcan una proteína que le sea totalmente extraña.

¿Cómo lo logramos?

Necesitamos: Reconocer el gen adecuado que queremos copiar Cortar y pegar el fragmento de ADN Usar un medio de transporte para ese nuevo fragmento de ADN Insertar en el nuevo organismo Clonación Estudiar el éxito del procedimiento

¿Cómo encontrar el gen adecuado? IMANES BIOLÓGICOS: Sondas Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias a la región de ADN o ARN que queremos encontrar. Además contiene una “marca” que permite revelar su unión a la secuencia elegida. Son coloreadas durante su síntesis con nucleótidos marcados con isótopos radioactivos, con fluorescencia, con un marcador químico que puede ser detectado por un Ac o por una enzima cuya actividad produce el cambio de color de un sustrato.

¿Cómo cortar y pegar el fragmento de ADN? ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Video: http://www.mhhe.com/sem/Spanish_Animations/sp_restrictn_endonucleases.swf

Enzimas de restricción Son endonucleasas específicas capaces de reconocer secuencias palindrómicas de DNA y cortar los enlaces fosfodiéster del material genético en un punto específico. Palindrómicas quiere decir que leen en direcciones opuestas el mismo orden de nucleótidos. 5’ G T T A A C 3’ 3’ C A A T T G 5’

Enzimas de restricción Son suceptibles a cambios de temperatura, pH, etc. Estas enzimas se obtienen de células bacterianas. El nombre de estas está dado según el género y la especie de la bacteria de dónde se aisló por primera vez esta enzima.

Enzimas de restricción La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, la cuarta letra indica la cepa y el número al final indica el número de enzima que se ha aislado de esa cepa. Por ejemplo: EcoRI Otros ejemplos: BamHI – la primera que se aisló de la cepa H de Bacillus amyloliquefaciens SmaI – la primera que se aisló de Serratia marcesens HindIII – la tercera que se aisló de la cepa d de Haemophilus influenzae Primera enzima aislada de ese organismo. Escherichia (género) coli (especie) cepa R

Tipos de corte “Blunt” o abruptos Ejemplo SmaI “Sticky”/ pegajosos/ cohesivos – es más fácil para volver a ligarse los extremos. Ejemplos EcoRI Bam HI HindIII

Enzimas de restricción Las endonucleasas son de gran importancia para la ingeniería genética, ya que permiten desarrollar técnicas de clonación. Permite realizar mapas de restricción y determinar si existe homología entre otras moléculas de DNA. Son extraídas de bacterias, donde actuan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula.

Enzimas que cortan moléculas de DNA en una cantidad limitada de ubicaciones específicas. Son específicas y reconocen una secuencia de DNA corta determinada (sitio de restricción), para cortar ambas cadenas de DNA en puntos específicos de este sitio. El DNA de una célula bacteriana se protege de las propias enzimas de restricción agregando –CH3 a las adeninas o citosinas dentro de las secuencias reconocidas por las enzimas (Mecanismo de metilación)

Sitios de restricción simétricos (5´ 3´) Reconocen secuencias que contienen que contienen entre cuatro y ocho nucleótidos (pb) Produce muchos cortes produciendo un conjunto de fragmentos de restricción La mayoría dividen los esqueletos de azúcar y fosfato en ambas cadenas de DNA de forma escalonada.

Los fragmentos resultantes tienen un extremo monocatenario (extremo cohesivo o pegajoso/romos), los cuales pueden unirse con los extremos cohesivos complementarios en otras moléculas de DNA de forma temporal a través de uniones pte. de hidrógeno Las asociaciones son permanentes a través de una ligasa que cataliza la formación de enlaces covalentes que cierran los esqueletos de azúcar-fosfato

Existen 3 tipos de enzimas de restricción: 1. Tipo I y Tipo III: a.      Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). b.      Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo.  Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen. c.      Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte. 2.         Tipo II: a.      Sólo tienen actividad de restricción. b.      Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c.      Sólo requieren Mg++ como cofactor. d.      No necesitan ATP.  

Endonucleasas

Usos de las enzimas de restricción Las enzimas de restricción tienen diferentes aplicaciones que son de gran importancia en investigaciones en biología molecular y en las técnicas que emplea la biotecnología moderna: 1. Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago. El ADN se corta con varias enzimas de restricción, solas y en parejas, para determinar el número de sitios de corte y sus posiciones relativas en la molécula, el orden y la distancia entre ellos.  2. Fragmentar ADN para separación por electroforesis. Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos fragmentos. Por ejemplo: para la técnica de Southern blotting o en las usadas para identificar polimorfismos de ADN en distintos individuos.  

3. Generación de fragmentos para ser clonados en los vectores apropiados, y crear ADN recombinante. Se puede cortar una molécula de ADN con una enzima y con el mismo tipo de enzima, cortar el fragmento de ADN de interés para clonar. Se unen con ligasas estas dos moléculas de ADN, generando así una molécula de ADN recombinante. Este vector recombinante puede usarse para transformar células que expresen el gen de interés clonado (si se usó un vector de expresión con el promotor adecuado) o puede usarse simplemente para tener clonado (“guardado”) ese fragmento de ADN de interés. Por ejemplo: para los proyectos de secuenciación de genomas. 4. Generación de fragmentos para ser usados  como sondas marcadas en “Southern” y “Northern” blotting.  

¿Cómo introducir ADN recombinante en el nuevo organismo?

MÉTODOS UTILIZADOS PARA LA INTRODUCCIÓN DE ADN RECOMBIANTE Estos métodos son físicos o químicos. Los más empleados son los siguientes: Transformación Microinyección Lipofección Electroporación Transfección Microproyección o biobalística

Microinyección: método físico activo en el que se introduce el ADN recombinante en el interior celular con una micropipeta. Este método es utilizado cuando existe la necesidad de asegurarse que se ha introducido el ADN. Debido a la laboriosidad del proceso, sólo es utilizado sobre ovocitos o cigotos. Por contra, puede prescindirse del vector e introducir directamente el ADN seleccionado.

Lipofección: El ADN recombinante se introduce en liposomas, que son pequeñas vesículas fosfolipídicas. Estos liposomas se unen con la membrana celular y el ADN contenido en su interior se introduce en la célula.

Electroporación: método físico activo en el que una solución con células y ADN recombinante es sometida a descargas eléctricas de alto voltaje. Esto altera la permeabilidad de la membrana, permitiendo la entrada del ADN recombinante.

Transfección: método físico activo de gran eficacia, donde el vector es un virus. El virus introduce el ADN recombinante mediante el mecanismo normal de infección viral.

Microproyección o biobalística: método físico activo en el que se utiliza una micropistola que dispara microbalas de acero en las que va impregnado el ADN. Se utiliza sobre suspensiones celulares, cultivos celulares o "in vivo" sobre órganos como piel, hojas, etc.

Transformación: es un tratamiento físico-químico para bacterias Transformación: es un tratamiento físico-químico para bacterias. Se produce una variación de la permeabilidad de la membrana. En ese momento se dice que la célula es competente, ya que pueden penetrar los ADN recombinantes en el interior celular. Las células se hacen competentes cuando en un cultivo celular a 0ºC, con presencia de Ca++, se produce un brusco cambio de temperatura, llegando a 37º-43ºC. Requiere un vector.

TIPOS ¿Qué es un vector? Naturales Artificiales Plásmidos Son plásmidos, virus, fagos (virus que infectan exclusivamente a las bacterias), cósmidos (vectores de clonación, que han sido ampliamente usados en la elaboración de genotecas de DNA genómicos de gran tamaño) capaces de mover genes de un organismo a otro y son capaces de ingresar a una célula y replicarse dentro de ella. Plásmidos Bacteriófagos Naturales Cósmidos YACs MACs Artificiales TIPOS

Tipos de vectores Plásmidos Los plásmidos fueron los primeros vectores que se desarrollaron, y aún son ampliamente usados. Estos vectores proceden de moléculas de ADN de doble cadena extracromosómicas que se encuentran de manera natural y que se replican autónomamente dentro de las células bacterianas. Generalmente son derivados del pBR322. - Es pequeño, de modo que puede transportar fragmentos de ADN relativamente grandes (de unos 10.000 pares de bases). - Tiene un origen de replicación (ORI) y puede producir hasta 500 copias de los fragmentos de ADN insertado por célula. - Se ha modificado para que presente muchas secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción que se han agrupado en una región denominada polylinker. - Permite la identificación sencilla de los plásmidos recombinantes, ya que contiene un fragmento del gen bacteriano lacZ que produce colonias de color azul. Si se inserta un fragmento de ADN en el polylinker, se inactiva este gen, y da lugar a colonias de color blanco.

Tipos de vectores Bacteriófago lambda Para ser utilizado de vector, el tercio central de su cromosoma puede ser reemplazado por ADN foráneo, sin que ello afecte a la capacidad del fago de infectar células y formar cápsides. Para clonar ADN utilizando este vector, se purifica el ADN del fago y se corta con una enzima de restricción, con la misma enzima de restricción cortamos el fragmento de ADN de interés y los unimos con una ADN ligasa. Los vectores lambda recombinantes se empaquetan in vitro en las cápsides proteicas del fago, y se introducen en células huésped bacterianas. Dentro de las bacterias, los vectores se replican y forman muchas copias del fago infectivo, llevando todas ellas el fragmento de ADN de interés en la clonación. Los vectores fágicos pueden transportar fragmentos de hasta 20 kb (20000 nucleótidos) Cósmidos Los cósmidos son vectores híbridos utilizando partes del cromosoma de lambda y de plásmidos. Tienen una sección del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento del ADN del fago dentro de su cubierta proteica, además contienen secuencias plasmídicas necesarias para la replicación y genes de resistencia a antibióticos. Los cósmidos pueden transportar casi 50 kb de ADN insertado. YACs Los YACs son cromosomas artificiales de levadura. Un YAC tiene telómeros en sus extremos, un origen de replicación y un centrómero. Estos componentes están unidos a genes marcadores de selección y a un grupo de enzimas de restricción para insertar ADN exógeno. Estos cromosomas artificiales de levadura permiten clonar grandes trozos de ADN, de 100 a 1000 kb. MACs Cromosomas Artificiales de Mamíferos.

Tipos de vectores En resumen Plásmido: Molécula de ADN circular que se replica de manera autónoma dentro de una bacteria. Fago: Molécula de ADN lineal cuyas secciones pueden remplazarse con ADN extraño sin interrumpir su ciclo de vida. Cósmido: Molécula de ADN circular extra- cromosómico que combina características de plásmidos y fagos. YACs: Cromosomas Artificiales de Levadura. MACs: Cromosomas Artificiales de Mamíferos.

Partes necesarias de un vector Orígen de Replicación (ORI): Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de DNA, el cual le da la cualidad de poder replicarse de manera independiente al DNA cromosómico, ya sea en un sistema bacteriano o en un sistema de expresión en levaduras. Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector, los cuales le confieren características adicionales al sistema de clonación (bacterias, levaduras, etc.), que permiten la identificación y selección de las clonas recombinantes, es decir, clones que contienen el fragmento de DNA de interés. Ejemplos de esto son los genes que codifican para la resistencia a antibióticos, como lo son los de resistencia a la ampicilina o a la tetraciclina, o por el contrario, pueden ser marcadores metabólicos como el gen Lac Z, que codifica para la síntesis de la enzima beta galactosidasa. Polilinker o Sitio de Multiclonación: Múltiples sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción, que permiten la inserción de los fragmentos de DNA que se desea clonar en un sistema.

Plásmido 1- Los plásmidos son moléculas de DNA extracromosómico, covalentemente cerrados y generalmente de tamaño pequeño. 2- Se encuentran en muchas especies bacterianas. 3- Son capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciación (ORI). Esto le permite replicarse de manera independiente del ADN genómico. 4- Pueden contener genes que contribuyen a la superviviencia en condiciones especiales.

Plásmido Así, los plásmidos se utilizan como vectores de fragmentos de ADN. Para esto, se combina el fragmento de ADN con el plásmido, generando un nuevo plásmido con dicho gen en su secuencia. ¿Cómo?

Plásmido Para esto, se debe utilizar sobre el plásmido, la misma enzima de restricción, que rinda los mismos extremos del fragmento de ADN previamente seccionado. Y por medio de una ligasa, permita la unión entre en fragmento de ADN y el plásmido utilizado.

¿Cómo decido qué enzima de restricción debo utilizar sobre el plásmido? Cada plásmido utilizado, posee una secuencia específica de nucleótidos. En base a dicha secuencia, se reconoce qué enzima de restricción se pueden utilizar y en qué sector de plásmido van a realizar el corte. Teniendo en cuenta que debe corresponderse al fragmento de ADN seleccionado.

Ejemplo: Plásmido pBR322 Fue el primer plásmido artificial y es uno de los vectores más comúnmente usados en E. coli Contiene 4361 pb y su principal característica es que contiene dos genes de restricción a antibióticos: Ampicilina y Tetraciclina.

Plásmido pBR322 Secuencia de bases

Plásmido pBR322 Mapa de restricción

Plásmido pBR322 Referencias: ApR: Gen de resistencia a la Ampicilina En conjunto de su secuencia de bases y su mapa de restricción, puedo diseñar el siguiente diagrama: Referencias: ApR: Gen de resistencia a la Ampicilina TcR: Gen de resistencia a la Tetraciclina. EcoRI: Zona de corte de la enzima de restricción EcoRI BamHI: Zona de corte de la enzima de restricción BamHI PstI: Zona de corte de la enzima de restricción PstI ColE1 origin: ORI del plásmido.

Plásmido Una vez seleccionado el plásmido y la secuencia recombinante, debo elegir la enzima de restricción a utilizar. Prestando especial atención a: Cortes en ADN recombinante, así como en plásmido. Prestar atención a las zonas del plásmido que quiero mantener o eliminar. Origen de replicación Genes plasmídicos

Clonación Para la clonación (replicación del ADN recombinante) se necesita la maquinaria celular. Por ello, hay que introducir el ADN recombinante en una célula anfitriona. Los tipos de células anfitrionas son: Células bacterianas: son las más utilizadas, ya que tienen una alta velocidad de replicación, un bajo costo de mantenimiento de las colonias y son fácilmente manipulables. Células eucariotas: aunque las células eucariotas son, en general, difíciles de mantener se usan levaduras y células tumorales: Levaduras: se utilizan en procesos relacionados con la investigación de la expresión y la regulación génica y la síntesis de proteínas eucariotas. Células tumorales: apropiadas en procesos de clonación, ya que la velocidad de replicación es muy alta y se mantienen los caracteres sin producirse cambios, pues son muy estables. Los métodos para la introducción del ADN recombinante facilitan la entrada de grandes fragmentos de ADN, puesto que la membrana celular es selectiva y no permitiría la penetración de grandes moléculas.

Resumiendo http://www.bionova.org.es/animbio/anim/IngGen2web.swf

Proceso mediante el cual se obtiene la insulina

Ingeniería genética (otros usos) USOS Y APLICACIONES DE LA INGENIERÍA GENÉTICA Entre los usos y aplicaciones podemos nombrar: - Mejorar las vacunas contra las enfermedades de los animales. - Productos humanos puros, como la insulina y la hormona del crecimiento humano en cantidades comerciales. - Antibióticos existentes por métodos más económicos. - Nuevos tipos de antibióticos. - Plantas con resistencia a algunos pesticidas, insectos y enfermedades. - Plantas con cualidades nutricionales mejoradas. En un humano, se pueden resaltar los siguientes usos: - Para reparar un defecto genético. - Para incrementar un proceso natural del organismo (como la tasa de crecimiento). - Para crear resistencia a las enfermedades o al daño externo. - Para evitar que el organismo haga algo que no haría normalmente. - Para obtener microorganismos que producen la insulina de los humanos para los diabéticos. - Han aumentado las expectativas de los científicos en eliminar enfermedades como el cáncer, y aumentar la longevidad eliminando las desventajas del crecimiento. - La clonación y el genoma humano