FRECUENCIA DEL GEN CTX-M EN Escherichia coli UROPATÓGENAS AISLADAS EN EL HOSPITAL GUILLERMO ALMENARA DE MARZO A MAYO Méndez Ruiz Ema 1, Díaz Tello José 2, García-de-la-Guarda Ruth 1 1 Laboratorio de Microbiología Molecular y Biotecnología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima – Perú 2 Servicio de Microbiología, Dpto. de Patología Clínica, Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen (HNGAI), Lima – Perú ANTECEDENTES Y OBJETIVOS MATERIALES Y MÉTODOS De todas las infecciones, las del tracto urinario (ITU) son después de las infecciones de las vías respiratorias, las más frecuentes en la atención primaria (Leones et al., 2002). Los patógenos que causan estas infecciones son varios, pero el más común es Escherichia coli. Entre los antibióticos usados en el Perú para la terapia de las infecciones urinarias destacan las cefalosporinas (Echevarría-Zarate et al., 2006; Chiarella et al., 1993; Miyahira, 1994) y el mecanismo más importante de resistencia a estos antibióticos en las enterobacterias es la producción de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) (Castro et al., 2008). Hay varios tipos de BLEE, entre ellas las TEM, SHV y OXA, pero en 1989 se encontró un aislado clínico de Escherichia coli que producía una enzima diferente a éstas a la que se le denominó CTX-M por su actividad hidrolítica preferente sobre la cefotaxima. Las BLEE tipo CTX-M han adquirido relevancia epidemiológica por su dispersión intra y extrahospitalaria (García-Hernández et al., 2011). Se han hecho investigaciones que demuestran que los aislados de E. coli productores de BLEE tipo CTX-M son prevalentes en Sudamérica (Muñoz y García- Rodriguez, 2003), sin embargo en el Perú son pocos los estudios realizados al respecto. El objetivo de este estudio fue determinar a nivel fenotípico y molecular la presencia y frecuencia de genes que codifican BLEE del tipo CTX-M en cepas de E. coli provenientes de urocultivos. Es un estudio observacional. Se colectaron 50 cepas provenientes de urocultivos del HNGAI entre marzo y mayo del Se confirmó la identificación de los aislados y se realizó el antibiograma mediante la técnica de Kirby – Bauer. La determinación de la producción de BLEE se hizo siguiendo los criterios del CLSI (2010) así como el método de Jarlier et al. (1988) (Fig. 1). Los plásmidos se extrajeron con el kit PureYield ™ Plasmid Miniprep System, Promega. El gen blaCTX-M se evidenció mediante amplificación por PCR usando los primers Bla CTX- M (F) 5´TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA3´ y Bla CTX-M (R) 5´CGATATCGTTGGTGGTGCCAT3´ (Edelstein et al., 2003), usando como DNA molde los plásmidos extraídos. La PCR se realizó usando el kit KOD Hot Start (Novagen) y un termociclador MasterCycler® Personal (Eppendorf) que se programó como sigue: 95°C por 2 minutos, 34 ciclos de 95°C por 30 segundos, 58°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos, y una elongación final de 72°C por 5 minutos. Para evidenciar tanto la presencia de plásmidos como de los amplificados, se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE 0.5X, tinción con bromuro de etidio y fotografiado en un transiluminador UV. RESULTADOS CONCLUSIONES De las 50 cepas recolectadas, 36 se identificaron como Escherichia coli, representando el 72% de la muestra (Fig. 2). De éstas, el 58.3% (21 cepas) eran productoras de BLEE y presentaron plásmidos (Fig. 3), de las cuales el 85.7% (18 cepas) portaban el gen de resistencia blaCTX-M (Fig. 4). Como se puede apreciar la prevalencia de E.. coli uropatógenas portadoras de blaCTX-M es alta, lo que coincide con los cambios epidemiológicos que se han dado en los últimos años en todo el mundo. Asimismo, el haber demostrado que se encuentran en plásmidos, significa que éstos se pueden diseminar con facilidad, lo que se debe tomar en cuenta en la vigilancia de la resistencia para su control. 1.- El principal agente etiológico en urocultivos del Hospital Guillermo Almenara Irigoyen, entre marzo y mayo del 2012 fue Escherichia coli productora de BLEE. 2.- El mecanismo de resistencia por BLEE en Escherichia coli de urocultivos fue de 58.3% del total de la muestra. 3.- El gen blaCTX-M que codifica BLEE es altamente prevalente (85.7%) y es portado en plásmidos en E. coli aisladas de urocultivos. En el marco de las recomendaciones de la OMS acerca de la necesidad de estudiar los mecanismos moleculares de resistencia a antimicrobianos y considerando que en el Perú se hacen muy pocos estudios de este tipo, esta investigación aporta datos valiosos a las estadísticas de nuestro país y conocimientos necesarios para contribuir a la mejora de los programas de vigilancia de la resistencia intentando controlar la diseminación de estos genes. REFERENCIAS Castro et al. Caracterización Molecular de β-lactamasas de Expectro Extendido en Aislamientos Clínicos de Escherichia coli. Revista de Enfermedades Infecciosas y Microbiología. 2008, vol. 28, n° 3, p Chiarella et al. Infección del tracto urinario en pediatría: Etiología y tratamiento. Revista Médica Herediana Vol. 4, n° 4. CLSI. Performance Standards of Antimicrobial Susceptibility Testing, Twentieth Informational Supplement. M100-S20. USA Vol. 30, n° 1. Echevarría-Zarate et al. Infección del tracto urinario y manejo de antibiótico. Acta Médica Peruana. 2006, vol. 23, n° 1, p Edelstein et al. Prevalence and Molecular Epidemiology of CTX-M Extended-Spectrum β-Lactamase-Producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian Hospitals. Journals Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2003, vol. 47, n° 12, p García-Hernández et al. Bacteriemias por Escherichia coli productor de betalactamasas de espectro extendido (BLEE): significación clínica y perspectivas actuales. Revista Española de Quimioterapia. 2011, vol. 24, n° 2, p Jarlier et al. Extended broad-spectrum betalactamasas conferring transferable resistance to newer beta-lactam agents in Enterobacteriaceae: hospital prevalence and susceptibility patterns. Reviews of Infectious Diseases. 1988, vol. 10, n° 4, p Leones et al. Etiología y resistencias bacterianas de las infecciones urinarias en un centro de salud rural. Revista Medicina de Familia (And). 2002, vol. 3, n° 2, p. 104 – 107. Miyahira J. Infección urinaria intrahospitalaria en los servicios de hospitalización de Medicina de un hospital general. Revista Médica Herediana Vol. 5, n° 2, Abril-Junio. Muñoz y García-Rodriguez. Detección de mecanismos de resistencia. Revista de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. 2003, vol. 21, n°2, p Figura 1. Determinación fenotípica del mecanismo de resistencia por BLEE. Los discos se colocaron a una distancia de 25mm de centro a centro. La resistencia se evidencia por la extensión del halo de inhibición del crecimiento (línea punteada) de CTX hacia AMC (método de Jarlier), y por una diferencia igual o mayor a 5mm en los halos de inhibición entre los discos de CAZ y CTA o CTX y CTI (método del CLSI). CTX=cefotaxima, CAZ=ceftazidima, AMC=amox/ac.clav, CTA=amox/ac.clav/ceftazidima, CTI=amox/ac.clav/cefotaxima). Figura 2. Frecuencia de E. coli uropatógenas productoras de BLEE. Figura 3. Plásmidos de E. coli BLEE separados por electroforesis en gel de agarosa. De izquierda a derecha, “M” marcador de tamaño molecular Lambda DNA/HindIII (Promega), cepas , , , , , , , , y el control negativo. Figura 4. Productos de PCR de blaCTX-M de E. coli BLEE uropatógenas separados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. De izquierda a derecha, “M” marcador de tamaño molecular Lambda DNA/HindIII (Promega), cepas , , , , y el control negativo.