ANTIBIOGRAMAS EN DISENTERIA Aleida Villa Espinosa, Rafael Baselga, Ana Fernández, Elena Gracia, Iñaki Albizu

DETERMINACION DE SENSIBILIDAD Para determinar la sensibilidad a los antibióticos se utiliza: Difusión en agar con discos Se utiliza para determinar la sensibilidad de bacterias aerobias de crecimiento rápido y, en condiciones estándar, el diámetro del halo de inhibición es inversamente proporcional a la Concentración Mínima Inhibitoria (MIC). Los resultados son orientativos, es cualitativa y no es válida para Brachyspiras. Prueba de las diluciones (MIC) La MIC es la menor concentración de antibiótico en la que no hay crecimiento. La forma adecuada de expresar la MIC es refiriéndose al 50% (MIC50) y al 90% (MIC90) de las cepas ensayadas (mínimo 50 cepas) y es la concentración a partir de la cual el 50% (o el 90%) de las cepas no crecen. Pone de manifiesto el grado de resistencia de la población, la sensibilidad de cada especie y de cada cepa. Antibiograma en agar Mueller Hinton incubado a 37º C 18 h. Los discos contienen diferentes concentraciones de antibióticos que difunden al medio impidiendo el crecimiento bacteriano.

CRITERIOS DE UTILIZACION DE LOS ANTIBIOTICOS Los antibióticos a los que las bacterias son medianamente sensibles, no se deben utilizar, a no ser: (1) que normalmente alcancen mayor concentración en el foco de infección, o (2) que no se disponga de otro agente antimicrobiano, en cuyo caso se deben administrar las mayores dosis posibles. 1 Sensible: Cuando el microorganismo infectante se inhibe por las concentraciones que un antibiótico alcanza en los tejidos administrado a las dosis usuales. Un microorganismo es considerado sensible si la MIC de este es inferior a la mitad de la concentración media alcanzada en la sangre, o es inferior a la cuarta parte de la cifra media de las concentraciones máximas. Medianamente sensible: Si el microorganismo sólo es inhibido por las concentraciones que el antibiótico alcanza en la sangre o en los tejidos cuando se administra la mayor dosis posible del mismo Resistente: Si el microorganismo no resulta afectado por las concentraciones que normalmente se alcanzan en el organismo, y son toleradas por él. 2 3 Estos conceptos establecen una relación entre la concentración que los distintos fármacos alcanzan en los tejidos y la MIC, la cual constituye el parámetro de referencia para determinar la sensibilidad.

RESULTADO CLINICO Los resultados pueden ser no válidos para pronosticar el resultado clínico: Factores dependientes de las bacterias: Es posible "in vivo" las bacterias sean más sensibles porque pierdan factores de virulencia. Factores dependientes del hospedador: Es posible que las bacterias sensibles no resulten afectadas debido a su localización intracelular, su fase metabólica, presencia de pus, o productos de necrosis, etc. Factores dependientes del fármaco: Se incluyen: la administración de dosis insuficientes, la utilización de una vía de administración incorrecta, el empleo de un fármaco no apropiado, la inactivación del fármaco, tanto in vivo como in vitro y la escasa penetración del fármaco en los tejidos, debida a la existencia de barreras fisiológicas o de extensas zonas de necrosis. a b c

ANTIBIOTICOS SELECCIONADOS PARA EL CONTROL DE LOS PROCESOS DIGESTIVOS EN CEBO* Tilosina Lincomicina Tiamullina Valnemulina Clortetraciclina Espectinomicina Apramicina Neomicina Sulfamidas/Trimetropin Amoxicilina Penicilina B. Bueno, M. Malo, mod. Moderado ANTIMICROBIANO L. Intra- cellularis. B. Hyody- senteriae Pilosicoli C. Perfrin- gens E. coli Salmonella sp. Yersinia B M mod mod. *(Burch, D.G.S., http://www.octagon-services.co.uk/articles/ileitis.pdf)

ABSORCION RELATIVA, O CONCENTRACIONES INTESTINALES DE VARIOS ANTIBIÓTICOS* Lincomicina 110 ppm Lincomicina 220 ppm Tiamulina 110 ppm Tiamulina 220 ppm Valnemulina 75 ppm Valnemulina 200 ppm Tilosina 100 ppm Clortetraciclina Espectinomicina Apramicina Neomicina Moderada (50%) Alta (>90%) Baja (<20%) 48 25 - 35 101 2.8 8 1.7 5.2 50 ABSORCIÓN APROXIMADA CONCENTRACIÓN EN ILEON (µG/ML) EN COLON (µG/ML) ANTIMICROBIANO *(Burch, D.G.S., http://www.octagon-services.co.uk/articles/ileitis.pdf)

ESQUEMA DE TRABAJO CON BRACHYSPIRAS Esquema de trabajo para determinar la sensibilidad de Brachyspira sp. a los agentes antimicrobianos utilizando la prueba de las diluciones y lectura en Citometría de Flujo. En las placas de ensayo de 96 pocillos de un ml de capacidad se ponen los medios de crecimiento (1 ml; BHI con 10% de Suero Fetal Bovino) donde se multiplicarán las Brachyspiras. En otras microplacas de 96 pocillos se preparan las 8 diferentes concentraciones decrecientes (1/2) de cada antibiótico (Lincomicina, Tiamulina, Tilosina, Valnemulina).

Los antibióticos concentrados se añaden a las microplacas donde se prepararan las diluciones de los antibióticos. Las diluciones dobles de los antibióticos se realizan pasando consecutivamente 150µl con una pipeta multicanal a otro pocillo con 150µl del medio de crecimiento sin antibiótico. La placa con las diferentes concentraciones de antibiótico queda lista. En cada placa se dejan pozos control con medio sin antibiótico para los controles de pureza y la evaluación del crecimiento de la población a 0 y 48 h.

Las diluciones de antibiótico preparadas se traspasan a las placas de ensayo. En cada pocillo de las placas de ensayo tenemos una concentración y un antibiótico diferente, tal y como se van a ensayar. Las cepas se preparan a partir de un cultivo de 48 horas a 42ºC en agar Columbia.

Se deposita 1,5 ml de BHI sin suero sobre las placas con los cultivos antes de recoger las bacterias con el asa sobre las áreas de hemólisis. La suspensión bacteriana se mezcla bien y se distribuye en los microtubos de las placas de ensayo.

Las placas de ensayo se incuban en anaerobiosis para permitir el crecimiento de las Brachyspiras. Se confirma la pureza del inóculo a partir de uno de los microtubos de control. Para realizar la lectura objetiva de los pocillos, las bacterias que se han multiplicado se diluyen en PBS antes de contarlas en el citómetro. Un citómetro cuenta el número de bacterias presentes en un vólumen determinado al hacerlas pasar por un microcapilar.

La lectura de los datos se realiza en un citómetro de flujo de un modo totalmente objetivo, comparando el crecimiento y viabilidad de las bacterias en cada uno de los pocillos (un pocillo por cepa y dilución de antibiótico) y su viabilidad con el crecimiento y viabilidad promedio que se obtiene en los pocillos control. El citómetro lee cada una de las bacterias presentes en el medio de crecimiento (cada punto es una bacteria) y además de contarlas para estimar su concentración, utilizando Ioduro de Propidio como marcador estima su viabilidad.

ANTIBIOGRAMA FRENTE A BRACHYSPIRAS Aislamiento: Brachyspira hyodysenteriae Antibiograma: Se utilizó un método cuantitativo de microdilución en caldo BHI enriquecido con el 10% de Suero Fetal Bovino y se analizo por Citometría de Flujo después de 48 horas de incubación a 42ºC frente a un panel de 4 antibióticos y 8 diluciones de cada uno de ellos. Punto de corte: El punto de corte estimado corresponde al 50% de inhibición del crecimiento contra el control de la misma cepa sin antibiótico. Lincomicina Tiamulina Tilosina Valnemulina 1 64 4 256 2 32 128 3 16 8 0,5 5 0,3 6 7 0,1 CONCENTRACIONES ENSAYADAS EXPRESADAS EN µG/ML:

RESULTADOS SENSIBILIDAD IN VITRO: ATB A ATB B ATB C ATB D Sensible ANTIBIÓTICO Todos los antibióticos son capaces de inhibir el crecimiento de las bacterias en alguna de las concentraciones ensayadas Sensibilidad Clínica: Valor obtenido en la menor concentración por debajo del punto de corte (50% de inhibición) multiplicado por 3. Este valor se compara con las concentraciones que se alcanzan en intestino. A B C D 16 <0.031 32 34,51 2,16 N.D. 1,68 Valor punto de corte Concentración en intestino SENSIBILIDAD CLÍNICA: CONCLUSIONES: La cepa estudiada no presenta ninguna resistencia frente a ATB B y el ATB D, mientras que tanto frente a la ATB A como frente a ATB C podemos sospechar que estamos muy cerca del límite de sensibilidad clínica.