IMPORTANCIA DEL DIAGNOSTICO MOLECULAR EN LAS LEUCEMIAS DRA. EDA GUADALUPE RAMIREZ VALLES

Biología Molecular Puede ser definida como una disciplina que se ocupa del estudio de la vida a nivel molecular. Se fundamenta en un “dogma central”, que establece el flujo de la información genética en la célula (DNA, RNA, Proteína).

El genoma Los cromosomas están formados por ADN que contiene toda la información genética de una célula. Los genes determinan nuestro código genético.

El genotipo Es el contenido genético de un individuo en forma de ADN La secuencia de nucleótidos constituye la cadena de ADN y el conjunto de genes de un organismo.

El fenotipo El Fenotipo es la Las características físicas de cada persona vienen determinadas por nuestro código genético El Fenotipo es la expresión del Genotipo de cada persona individualmente

Molécula de ADN

Codón

Codón

Proteína

Proteína

Todas las células de un individuo tienen los mismos genes 99% homología Homo sapiens  99.9% idénticos Pan troglodytes Fenotípicamente, son muy diferentes…Porqué?

Expresión génica Es la combinación de qué genes están activos y cuáles inactivos lo que hace que cada célula sea diferente Expresión Genes inactivos

Leucemias Neoplasia maligna derivada de la proliferación anormal de leucocitos en la médula ósea que secundariamente pasarán a circular al torrente sanguíneo.

Origen de la Leucemia La translocación cromosómica es el mecanismo genético más importante involucrado en la patogenia de la leucemia aguda.

Origen de la Leucemia Esta alteración puede activar un proto-oncogen, que determina la síntesis aumentada de una proteína anormal, que: altera la diferenciación la velocidad de crecimiento y la sobrevida de la célula comprometida.

CLASIFICACIÓN SEGÚN LA OMS Leucemia Mieloide Linfoide Aguda Crónica Chávez Gonzales et al, La Leucemia Mieloide Crónica En El Siglo XXI :Biología Y Tratamiento. Revista De Investigación Clínica 2009.

Un problema de frenos y acelerador Cáncer: Un problema de frenos y acelerador Enfermedad genética producida por la mutación de determinados genes en una célula determinada. 2 tipos de genes implicados en el cáncer... Oncogenes Genes supresores de tumores

Mutación Alteración de la secuencia del ADN original. Esto provoca cambios en la información genética del individuo.

Oncogenes En condiciones normales hacen que la célula avance en su ciclo y se divida. Si están hiperactivados debido a una mutación, la célula se reproduce sin control. Aceleradores Cuando estos genes se expresan más de la cuenta, pueden causar cáncer.

Genes supresores de tumores Regulan el ciclo de división celular, arreglan anomalías ADN y si la célula tiene una lesión en el ADN apoptosis Mutados, la célula es incapaz de suicidarse y continúa dividiéndose de manera defectuosa Frenos Cuando estos genes no se expresan, pueden causar cáncer

OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Conocer: Cómo se regulan los genes Cómo funcionan las proteínas resultantes Cómo se alteran en situaciones patológicas específicas . Translocación

OBJETIVO DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Para hacer: Un diagnóstico adecuado Acciones terapéuticas curativas (tratamientos dirigidos a la alteración molecular) Permitir el diseño de pautas preventivas (seguimiento del paciente)

Diagnóstico de la LMC Esta enfermedad presenta una alteración molecular debido a la translocación de 2 cromosomas, que dan lugar al cromosoma Filadelfia.

Diagnóstico de la LMC Si se detecta la presencia de esta alteración molecular podemos corroborar el diagnóstico con la ayuda de otros criterios Activación del gen Existen tratamientos con fármacos que van dirigidos a bloquear la proteína que se activa por la fusión de este gen BCR-ABL, y de esta manera evitar la proliferación descontrolada Fármaco que impide la activación del gen

VÍA DE SEÑALIZACIÓN PI3- K/Akt Ser473 Thr308 Rodgers and Theibert, VÍA DE SEÑALIZACIÓN PI3- K/Akt 2002.

Diagnóstico de la LMC La pauta preventiva se realizaría comprobando la cantidad de copias del gen durante el seguimiento del paciente para determinar si este gen sigue expresándose o no. Gráfica del seguimiento del paciente

Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de las Leucemias 1. Extracción de ácidos nucleicos 2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional 5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa

Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC Mayor sensibilidad Mayor especificidad y rapidez Menores requerimientos mínimos de muestra 1. Extracción de ácidos nucleicos 2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional 5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa

Separación de células 1. Separación de las células que nos interesan mediante centrifugación por Gradientes de densidad. Los componentes de la mezcla se reparten en diferentes fases en función de la densidad y de la afinidad por los componentes químicos que utilizamos

Obtención de los ácidos nucleicos 2. Desnaturalización de los ácidos nucleicos. Se provoca la ruptura de la pared celular para que el ADN quede libre en la mezcla 3. Purificación del resto de componentes mediante centrifugación

Precipitación de los ácidos nucleicos 3. Precipitación de los ácidos nucleicos para formar un pellet celular que resuspenderemos en un tampón adecuado y a una concentración óptima

Valoración calidad/pureza El Espectrofotómetro mide la absorbancia de la luz a través de la muestra a una longitud de onda determinada RATIO: Abs 260/280 Concentración (ng) de ácidos nucleicos Restos de proteínas y alcoholes

Técnicas Moleculares para el Diagnóstico de la LMC 1. Extracción de ácidos nucleicos 2. Cuantificación 3. RT-PCR 4. PCR Convencional 5. Secuenciación Directa 6. PCR Cuantitativa 7. Southern blot 8. FISH

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Es como hacer un caldo... . + =

PCR 1. DNA MOLDE. Segmento de ADN de doble cadena que contiene la secuencia diana que queremos amplificar 2. PRIMERS. Pequeños fragmentos de ADN de cadena simple. Complementarios a los extremos flanqueantes del ADN molde. Marcarán el punto de partida y delimitarán la zona de ADN a amplificar

PCR 3. dNTPs. Suplemento de nucleótidos. A C G T 3. dNTPs. Suplemento de nucleótidos. Sustrato que usará la Polimerasa cuando produzca el nuevo ADN 4. DNA POLIMERASA. (Taq Polimerasa) Enzima que produce las copias de ADN 5. Tampón y MgCl2 . Adición de sales y un tampón que mantenga el pH adecuado en la mezcla

Veamos que pasa dentro del caldo...

Ciclos de amplificación

Desnaturalización La muestra se lleva a una temperatura de 94-96°C para que se rompan los puentes de hidrógeno y las dos cadenas del ADN molde se separen

Hibridación Los primers o cebadores que hemos añadido en la muestra actúan a una temperatura de entre 50 y 70ºC para unirse uno por cada extremo a las cadenas de ADN molde de manera complementaria. De esta manera delimitarán la zona a amplificar

Extensión La ADN polimerasa actúa a 72ºC para que se realice la extensión de las cadenas de ADN por complementariedad de bases entre los dNTPs y la cadena molde

Y esto es lo que ocurre...

Identificación de bandas Para visualizar el producto de la PCR utilizamos la electroforesis en gel de agarosa. Como conocemos el tamaño del gen a estudiar, visualmente podemos observar si está o no presente en la muestra.

PCR enTiempo Real Es una variante de la PCR que permite cuantificar el producto de la amplificación. Añadimos un fluorocromo que emitirá una fluorescencia con cada copia del ADN. Esto nos indicará si el gen está presente o no en la muestra, y de ser positivo, si se encuentra en mayor o menor cantidad

MUCHA SUERTE!!