Marcadores moleculares y su aplicación a la biomedicina Cátedra de Biología Molecular y Genética - 2012

Cariotipo Humano La dotación cromosómica humana está compuesta por 22 pares de autosomas y el par de cromosomas sexuales

Alelo y Mutación El concepto molecular de alelo es: cualquier alternativa en la información genética contenida en un locus determinado. En un organismo diploide cuando se presentan alelos idénticos es Homocigoto, si son diferentes es Heterocigoto. Molecularmente una mutación se entiende como cualquier cambio que modifica la secuencia de bases de un gen. En un sentido genéticamente funcional mutación es el cambio de un gen en su alelo.

Marcadores Moleculares Cuando la variantes en el genoma se presenta en la población con una frecuencia mayor al 1% se denominan polimorfismos. Los cambios fenotípicos heredables significativos son marcadores morfológicos. La variación de un solo nucleótido de ADN es un marcador molecular. Los marcadores moleculares se pueden definir como cualquier segmento específico del genoma que varían entre diferentes genotipos, pudiendo en algunos casos relacionarlos con un rasgo genético (Spooner et al., 2005).

Estructura de un gen

Biomedicina: Punto de partida para el estudio molecular de muestras.

Un ejemplo de aplicación

EJEMPLOS DE TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE POLIMORFISMO PCR, ARMS, RFLP, SSCP-HD Y SECUENCIACIÓN.

Polimorfismos ¿QUÉ TIPOS DE VARIANTES ALÉTICAS CONOCE? ¿QUÉ TIPOS DE SOPORTE DE CORRIDA ELECTROFORÉTICA CONOCIÓ EN ESTA MATERIA?

En la PCR se realizan de 20-40 ciclos

REACTIVOS PARA AMPLIFICAR AGUA LIBRE DE NUCLEASAS BUFFER MgCl2 dNTPs CEBADORES SENTIDO CEBADORES ANTISENTIDO TAQ POLIMERASA ADN MOLDE

TSER La proteína de este gen es el blanco terapeútico del quimioterápico 5-fluorouracilo, el cual se utiliza en el tratamiento de algunos tumores epiteliales. Esquema de la estructura de la región 5`-UTR TYMS con las tres repeticiones de la secuencia Un mayor número de repeticiones indicaría un aumenta la expresión proteica. Al menos un conjunto de estas repeticiones y su secuencia complementaria es necesario para una eficiente expresión y los posibles mecanismos para mejorar el efecto de la repetición podrían ser un factor desconocido nuclear que se une a la región, o la formación de tallo en los bucles de la región 5`-terminal del mRNA de TYMS.

Polimorfismo de TYMS 2R 3R 4R 5R 299 pb 271 pb 243 pb 215 pb PM S1 C- Gel de poliacrilamida al 10%, se amplificaron fragmentos a 243 pb en las dos muestras y en la muestra S1, también, se observa a 271 pb.

MÉTODOS DE ESTUDIO DE SNPs RFLP-PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA – POLIMORFISMOS EN LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN). ARMS-PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA – Sistemas de amplificación de mutaciones refractarias). ASO-PCR (REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA – Oligonucleótidos específicos de Alelo).

RFLP-PCR PCR Digestión enzimática

Ejemplo de RFLP

ARMS - PCR

Variante de ARMS

Gen CFTR: determinante de fibrosis quística

Fibrosis quística: Gen CFTR Los síntomas clínicos dependen de: Mutación Presencia de ambos alelos mutados. Coexistencia de dos mutaciones en el mismo alelo: “alelos complejos”. Detección de polimorfismos: PCR-ARMS: la mutación más frecuente deltaF508, es la primera que se determina para confirmar el diagnóstico. SSCP –Heterodúplex: es una técnica que permite detectar en un fragmento de PCR uno o más polimorfismos. Clases de mutaciones en el gen CFTR: I Bloquean la síntesis de la proteína II Afectan el procesamiento postraduccional. Ejemplo deltaF508. III Afectan la regulación del canal de cloro. Ejemplo G551D. IV Conductancia del canal de cloro. V Reduccion en la síntesis de la proteína.

Esquema representativo POLIMORFISMOS EN LA CONFORMACIÓN DE LA CADENA SIMPLE-HETERODÚPLEX (SSCP-HD)

MTHFR PAGE minigel showing induced heteroduplexes. Ejemplos con SSCP-HD Factor V Leiden PAGE minigel showing induced heteroduplexes. Prothrombin PAGE minigel showing induced heteroduplexes.

Gel de poliacrilamida con un fragmento amplificado (teñido con nitrato de plata).

Ejemplos con SSCP-Heterodúplex MTHFR PAGE minigel showing induced heteroduplexes. Factor V Leiden PAGE minigel showing induced heteroduplexes. Prothrombin PAGE minigel showing induced heteroduplexes.

SSCP-HD de los polimorfismos C749T y G846A de SSTR2 1s 2s 1d 2d 3s 3d 4s 4d 5s 5d 6s 6d 7s 7d 8s 8d 9s 9d M1s d M2s d M5s Gel de poliacrilamida al 10%, se observan los fragmentos amplificados que contienen los SNPs 749 y 846 de SSTR2. En los carriles 1 y 2, y los impares del 5 al 17 se observan las cadenas simples los individuos con cáncer de mama: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8. Los últimos 5 carriles contienen los controles.

Secuencia amplicada que contiene los polimorfismos del promotor del gen SSTR2.

PARA OBTENER LAS SECUENCIAS NUCLEOTÍDICAS A PARTIR DE UN AMPLICÓN DE UNA MUESTRA TENEMOS QUE SECUENCIAR.

Secuenciación de amplicones seleccionados

Alineamiento con el programa ClustalX

Si conocemos los polimorfismos o mutaciones que están relacionados con la enfermedad y el paciente no posee ninguno de ellos ¿Cómo podemos saber se hay otros cambios del mismo que afectan a la enfermedad? Y ¿Cómo hacemos para estudiarlas?