Trabajo Práctico N°2 VISUALIZACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Bqca. Marcela Alejandra Guastavino - Dra. María Mercedes Tiscornia – Cátedra de Biología Molecular y Genética. Carrera de Bioquímica-2015.

Objetivos Comprender el fundamento de la electroforesis en geles de agarosa. Realizar una corrida electroforética de DNA en geles de agarosa. Verificar la extracción del DNA aislado en el TP anterior mediante electroforesis. Interpretar el fundamento de la cuantificación de ácidos nucleicos mediante espectrofotometría.

ELECTROFORESIS DE DNA EN GELES DE AGAROSA PRIMERA PARTE

Microtubo de 1,5 ml con ovillo de DNA

Pasos para la extracción de Ácidos Nucleicos. Pesar Agarosa Preparar el Tris-Borato-EDTA a 0,5X y pH=8,2 Fundir, enfriar (colocar el colorante) y colocar en la cama Sembrar las muestras (con el colorante) y correr la electroforesis con las condiciones establecidas.

Fundamento de Electroforesis

Geles de Agarosa Antes, no era sencillo conseguir agarosa de alta pureza, (por que ésta se encontraba generalmente contaminada con otros polisacáridos, sales, proteínas, etc.) en la actualidad se obtienen preparados muy puros de agarosa y además se dispone comercialmente de agarosa químicamente modificadas que funden a baja temperatura (agarosas “low melting”). Se prepara un gel de agarosa de concentración apropiada al rango de los fragmentos a ser separados. OH CH2OH HO D-Galactosa 3,6 anhidro L-Galactosa

Sembrado de las muestras Las muestras de DNA se cargan en las hendiduras del gel (“slots” o pocillos) correspondientes y se aplica al mismo una diferencia de potencial determinada por un período de tiempo específico. Luego de preparar las muestras utilizando un buffer de carga conteniendo glicerol y un colorante que servirá como frente de corrida, se siembran las muestra en los pocillos y se permite que la electroforesis se desarrolle.

Tinción del Gel El gel es teñido con bromuro de etidio o GelRed y analizado bajo luz UV. La tinción puede ser un paso posterior a la corrida en sí o bien, como veremos más adelante, el colorante puede agregarse directamente al gel o a la muestra. Bromuro de Etidio Syber Green GelRed Gel Green Colorante No Tóxico Colorante Tóxico

Corrida electroforética Tamaño del DNA Cuando el DNA es sometido al campo eléctrico aplicado en la electroforesis, la migración de los fragmentos es inversamente proporcional a sus pesos moleculares (la especie más pesada es la que menos migra).

Corrida electroforética Concentración de la agarosa La migración depende del tamaño de poro formado por la agarosa, dicho tamaño depende de la concentración de agarosa. Existe una relación lineal entre el logaritmo y la movilidad electroforética del DNA y la concentración del gel, descripta a través de fórmulas matemáticas. Así a medida que aumentamos la concentración de agarosa permitimos la separación de fragmentos más pequeños de DNA.

Corrida electroforética Voltaje aplicado El voltaje aplicado a las terminales de un gel de agarosa genera un campo eléctrico con una fuerza definida por la longitud entre los electrodos y la diferencia de potencial total aplicada (se sugiere que la intensidad no debe exceder los 5 ó 6 V/cm). Las moléculas de DNA expuestas a éste campo eléctrico migran hacia el ánodo (polo positivo) debido a la carga negativa aportada por los grupos fosfato del esqueleto molecular. La velocidad de migración está limitada por la fuerza de fricción impuesta por la matríz del gel. 

Corrida electroforética Composición de bases y temperatura Mientras que la carga y/o tamaño molecular pueden afectar la velocidad a la cual las macromoléculas se movilizan a través del gel, el cociente de carga a masa (Q/M) es el mismo para moléculas de DNA de diferente tamaño. Por ello, el tamaño del DNA es la característica que determina la velocidad de migración, permitiendo la separación de mezclas complejas por electroforesis. Además la movilidad electroforética del DNA no se ve afectada por variaciones de temperatura (rango 4 a 30ºC) por lo que generalmente se llevan adelante corridas electroforéticas a temperatura ambiente.

Corrida electroforética Presencia de colorantes y Composición de la solución tampón (buffer) de corrida electroforética El bromuro de etidio puede reducir la movilidad electroforética del DNA lineal en aproximadamente un 15%.  La movilidad electroforética del DNA es afectada por la composición y la fuerza iónica del buffer de electroforesis. Sin iones la conductividad eléctrica es mínima y el DNA migra, si lo hace, muy lentamente. Si se usa un buffer de corrida con alta fuerza iónica puede fundir el gel y/o desnaturalizar el DNA. Los más utilizados son: TAE (Tris Acetato EDTA) y TBE (Tris Borato EDTA)

Buffer de carga Preparación de las muestras La muestra debe ser mezclada con un buffer de carga (“loading buffer”), el cual cumple con 3 funciones  A) Aumenta la densidad de la muestra. B) Asegura que el DNA se deposite directamente en el pocillo preparado a tal fin. C) Otorga color a la muestra, que se utilizado como “frente de corrida”. Glicerol 60%; EDTA 0,01 M; Azul de bromofenol 0,1%. Alternativamente colorante GelRed

Soporte Horizontal Siembre en un gel de agarosa

Muestra para la corrida electroforética Fragmentos de PCR y ADN Marcador de tamaño en pb (ladder) Muestras +

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA DE ADN GENÓMICO Electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con Bromuro de Etidio de DNA genómico a partir de sangre entera.

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA DE RNA TOTALES Gel de agarosa al 2% de RNA totales. Se observan bandas ribosomales con un peso de 4.5 kb 28S y 1.9 kb para 18S. Los RNAm no se  pueden fraccionar individualmente pues son moléculas menos pesadas y las proporciones en las que  se encuentran son menores producen smear 0.5 a12 Kb

Amplificaciones de cebadores diseñados para el promotor y los dominios de SHP-1. Exón 3 PM Exón 4 PM Exón 10 Exones 12_13 Gel de Agarosa 2 %: Amplificaciones de los cebadores para el promotor 1 (235 pb), los exones 3 (161 pb) , 4 (193 pb), 10 (192pb) y 12_13 (251pb) de SHP-1. El exón 8 (216pb) y el 13 (173pb).

SEGUNDA PARTE: CUANTIFICACIÓN Y VERIFICACIÓN DE LA PUREZA DE ÁCIDOS NUCLEICOS Ley de Lambert-Beer A es la absorbancia E es el coeficinete de extincion molar d es la longitud de la cubeta C es la concentración C = A 260/ E d ¿PUREZA? DNA PURO A 260/ A 280 1.6 a 1.8 < 1.6 a 1.8 PRESENCIA DE PROTEÍNAS 2 RNA PURO > 2.3 PRESENCIA DE NUCLÉOTIDOS

Muchas gracias por su atención!!