INGENIERÍA GENÉTICA. Terapia génica: concepto, tipos de vectores, metodologías y consideraciones.

TERAPIA GÉNICA Manipulación genética de las células utilizando procedimientos destinados tanto a reparar o incorporar nuevos genes en la célula como a bloquear o inhibir la expresión de ciertos genes, con fines terapéuticos Incorporar genes nuevos (transgénesis) Modificar genes propios de la célula Interferir con la expresión de los genes

TIPOS DE TERAPIA GÉNICA Germinal: los espermatozoides y óvulos son modificados, introduciendo o bloqueando genes que se integran en su genoma, con lo que el cambio podría ser heredable. Somática: el método se aplica a las enfermedades cuyo fenotipo provenga de genes expresados en un tejido.

Incorporar genes nuevos INSERCIÓN DEL GEN * VECTORES: - VIRALES: RETROVIRUS Y ADENOVIRUS - NO VIRALES: COMPLEJOS ADN-LIPOSOMAS CROMOSOMAS ARTIFICIALES HUMANOS * DIRECTAMENTE: ADN DESNUDO

CARACTERÍSTICAS DE UN BUEN VECTOR (DESTINO, ENTREGA Y EXPRESIÓN DEL GEN) Que pueda ser destinado con la mayor especificidad celular posible a un órgano o tejido. Que proteja al ADN de posibles degradaciones enzimáticas durante su transporte Que permita la expresión del gen con eficacia. Que no sea reconocido inmunitariamente ni provoque respuestas inflamatorias. Que sea seguro para el paciente y el entorno

VECTORES VIRALES MAS UTILIZADOS RETROVIRALES ADENOVIRALES

Los retrovirus son virus cuyo genoma (unos 9,7 kb) está constituido por una cadena simple de ARN y que replican mediante la formación de una cadena doble de ADN (provirus) como intermediario. En el ciclo vital del virus existe una etapa obligatoria en la cual la doble cadena de ADN se inserta en el genoma de la célula huesped llegando así a formar parte del material genético de la célula que infecta. El material genético del virus posee tres genes llamados gag, plo y env, que codifican nucleoproteínas, proteínas responsables de la síntesis o recombinación de los ácidos nucleicos y componentes de la envoltura de la partícula viral, respectivamente. Además poseen en los extremos secuencias LTR que le posibilitan su inserción en el ADN celular RETROVIRUS

VECTOR RETROVIRAL Los vectores retrovirales utilizados en terapia génica humana, pierden su capacidad de replicación al eliminar del virus las secuencias gag, pol y env. En contrapartida, al genoma viral se le incorpora una secuencia génica conteniendo el gen terapéutico . El vector retroviral, deficiente entonces en replicación , se amplifica mediante crecimiento en una línea celular especial (células empaquetadoras) que contienen en su genoma las secuencias gag,pol y env necesarias para la replicación y empaquetamiento del virus. El vector conteniendo el gen terapéutico infecta a la célula diana, utilizando receptores específicos y una vez en el citoplasma, la transcriptasa inversa (transportada por el vector) convierte el vector ARN en el ADN proviral el cual es integrado al azar en el genoma de la célula infectada y desde donde el gen expresará su producto terapéutico.

VECTOR ADENOVIRAL Doble cadena DNA Los adenovirus son virus cuyo genoma (aprox 36kb) está constituido por una doble cadena de ADN. El genoma de los adenovirus se divide en genes tempranos (E1 a E4) y genes tardíos (L1 a L5). Puesto que la capacidad del genoma adenoviral para su multiplicación reside en las secuencias ubicadas en E1, las estrategias para producir vestores adenovirales consisten en eliminar dichas secuencias e incorporar en su lugar el gen terapéutico, generando así un vector adenoviral sin capacidad de replicación. El posterior crecimiento y amplificación del vector se realiza utilizando una linea celular complementarias, que contiene la secuencia E1 en su genoma. Por último, el vestor adenoviral conteniendo el gen terapéutico se une a la célula diana mediado por receptores. El vector es internalizado y una vez en el endosoma se produce la lisis del mismo. El ADN viral conteniendo el gen terapéutico es liberado al citoplasma desde donde alcanza el núcleo y donde permanece como ADN extracromosómico (episoma) dirigiendo la expresión del gen terapéutico

VECTORES: - VIRALES: RETROVIRUS Y ADENOVIRUS - NO VIRALES: COMPLEJOS ADN-LIPOSOMAS CROMOSOMAS ARTIFICIALES HUMANOS

COMPLEJO ADN-LIPOSOMA Esta basado en la asociación del ADN plasmídico a vesículas formadas por autoensamblaje de bicapas de lípidos. Los liposomas catiónicos forman complejos ADN-liposomas para la transferencia de genes. La carga positiva del lípido facilita la interacción del liposoma tanto con el ADN como con la superficie celular, conduciendo a la entrada en la célula diana. Aunque la mayor parte del material genético transportado es secuestrado y/o degradado en los endosomas, una pequeña proporción alcanza el núcleo en donde permanece en forma de epicromosoma, permitiendo la expresión del gen terapéutico. Este tipo de liposoma es el único vector no-viral que ha demostrado ser suficientemente eficaz y seguro para iniciar ensayos clínicos

Vectores retrovirales: Secuencias de menos de 8 Kb Se insertan sólo en células en división Mutágeno si se inserta en un gen residente desconocido Riesgo de producir virus de tipo silvestre por recombinación Vectores adenovirales: Secuencias de hasta 35 kb Se insertan tanto en células en división como en reposo Índice de expresión del gen terapéutico elevado No se inserta en los cromosomas ADN-liposomas: No estimulan reacciones inmunitarias Baja eficacia

CROMOSOMAS ARTIFICIALES HUMANOS (HACs) Telómeros (ADN telomérico) Centrómeros (ADN alfa satélite repetitivo) ADN genómico

CROMOSOMAS ARTIFICIALES HUMANOS (HACs) Cromosoma independiente Transmisión a las células descendientes Grandes piezas de ADN

* DIRECTAMENTE: ADN DESNUDO INSERCIÓN DEL GEN * VECTORES: -VIRALES: RETROVIRUS Y ADENOVIRUS -NO VIRALES: COMPLEJOS ADN-LIPOSOMAS CROMOSOMAS ARTIFICIALES HUMANOS * DIRECTAMENTE: ADN DESNUDO

Métodos de introducción del gen ADN desnudo  baja eficacia de transfección

Estrategias terapéuticas: “Ex vivo” “In vivo”

Experiencia clínica: Tratamiento de la Inmunodeficiencia combinada grave, con deficiencia de adenosina-desaminasa (ADA) Trastorno autonómico recesivo Gen responsable de la sup. del receptor de las interleuquinas (desaminasa de adenosina). Impide la diferenciación de los Linfocitos T Los enfermos carecen de sistema inmune para hacer frente a infecciones triviales como catarros o gripes Ensayos clínicos: tratamientos ex vivo de precursores linfoides de medula ósea. Resultados muy satisfactorios El gen exógeno confiere ventaja selectiva a las células que lo incorporan, que proliferan mucho y colonizan toda la médula Solo hay un órgano enfermo : La médula ósea

1ª utilización de terapia génica (1990) para la inmunodeficiencia combinada grave

Ultimamente se ha levantado gran revuelo por la muerte de una paciente de 18 años (Jesse Gelsinger), quien por padecer de una grave enfermedad hepática había sido tratada por terapia génica, utilizando un virus aparentemente inocuo (adenovirus). A raíz de ello, el RAC ha comenzado a investigar más, y ha encontrado que en los últimos años se han producido varias muertes en pacientes sometidos a terapia génica. Pero el problema está en saber si ellas son la consecuencia de la terapia génica o de la gravedad de la enfermedad que padecían (en muchos casos ellos padecían de cáncer u otra enfermedad incurable). Según French Anderson de la Universidad de California en los Angeles, "son varios los enfermos que han fallecido durante el tratamiento con genes, pero ellos han sido enfermos terminales (especialmente de cáncer). Este caso sería la primera paciente que fallece debido a la terapia génica misma".

TERAPIA GÉNICA Incorporar genes nuevos (transgénesis) Modificar genes propios de la célula Interferir con la expresión de los genes

Modificar genes propios de la célula Reparación génica mediante oligonucleótidos: Reparar genes con una mutación puntual conocida Activar mecanismos de reparación del ADN

Interferir con la expresión de los genes Oligonucleótidos de ADN antisentido Ribozimas ARNi (ARN de interferencia)

El ARNi en la terapia génica

APLICACIONES ATACAR VIRUS: VIH (Sida), Poliomielitis, Hepatitis C... SILENCIAR GENES DE DIVERSAS ENFERMEDADES: Enf. Neurodegenerativas (Alzheimer, Parkinson...). En células en cultivo se consiguió anular el gen de la Esclerosis Lateral Amiotrófica. CÁNCER: ETIOLOGÍA Y TERAPIA (con Vacunas que estimulen el Sistema Inmunitario del paciente contra las células tumorales).

Medicina individualizada Estos cambios en el genoma podrian explicar las diferentes respuestas ante un tratamiento farmacológico. Es un paso más hacia la medicina individualizada. Con ella, las terapias estarán diseñadas para cada individuo concreto, según su personalísimo genoma.

HapMap Proyecto Hap Map “Mapa de Haplotipos” pretende identificar los patrones más comunes de variación de la secuencia de DNA humano en distintas poblaciones del planeta y facilitar la localización de genes relacionados con enfermedades. “The International HapMap Project “Nature 426, 789 - 796 (18 Dec 2003) http://www.hapmap.org/

NANOMEDICINA Rama de la nanotecnología que permitiría la posibilidad de curar enfermedades desde dentro del cuerpo, a nivel celular o molecular * Monitorización (imágenes) * Reparación de tejidos * Control de la evolución de las enfermedades * Diagnóstico, tratamiento y prevención * Administración de medicamentos a las células

Tissue Blood vessel Drug Optimal effects Pathology Targeting vector Enhanced affinity Drug Targeting vector Effective delivery Optimal effects Pathology

CONCEPTOS GENERALES Y ESTRATEGIAS PARA EL DIRECCIONAMIENTO DE FÁRMACOS Diana Vector de direccionamiento Tipos de transportadores