Manipulación de DNA Clonación Curso 2011-12

¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula? El problema básico ¿Cómo mantener estable un fragmento de DNA dentro de una célula? Uniéndolo a un vector de clonacion

Vector de clonacion DNA de replicación autónoma Multicopia Dianas de restricción unicas Fenotipo seleccionable

Diana única

Plásmidos recombinantes Quimeras

Pasos en la clonación Restricción del vector y del inserto Ligación Transformación Crecimiento en placas de agar en medio selectivo

Fragmentación de DNA Enzimas de restricción

Werner Arber Premio Nobel de Medicina en 1978 "for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics".

dabalearrozalazorraelabad Eje de simetría doble DIANAS de restricción Secuencias palindrómicas dabalearrozalazorraelabad ana anna

Romos Protuberantes

Enzimas de restricción Nº fragmentos en genoma humano Probabilidad de corte nomenclatura Nº fragmentos en genoma humano 1/4 x 1/4x 1/4 x1/4= (1/4)4 =1/256 1/4 4 ~ 12.5x106 fragmentos (1/4)6 = 1/4096 6 ~ 781250 fragmentos (1/4)8 = 1/65536 ~ 48828 fragmentos 8

Isosquizómeros Enzimas de restricción que reconocen la misma sequencia Pueden cortar en el mismo sitio Como NdelI y MboI GATC O no NarI GG CGCC BbeI GGCGC C EheI GGC GCC KasI G GCGCC

Ligación de DNA

3´ 5´

Animaciones> manipulación de DNA> techniques> cutting & pasting

Truco para favorecer la formación de recombinantes Impedir la religación del vector

Extremos cohesivos compatibles ¿Podríamos digerir el recombinante con BamHI?

….NGAT ATCN….. ….NCTA TAGN….. ….NGAT ….NCTA ATCN….. TAGN….. ….NCTA ….NGAT CCTN….. GGAN….. ….NCTA ….NGAT CCTN….. GGAN…..

Animación > Manipulation >Revolution > Players http://www.dnaftb.org/34/concept/index.html Premio Nobel de Química 1980

Vectores de clonacion Vectores plasmídicos

Características de los vectores de clonación Pequeño tamaño Marcador genético de selección Sitios únicos de restricción

ColE1

Vectores mejorados Mutación en las secuencias control de la replicación de ColE1 resultantes en más de 500 copias/célula Adición de múltiples sitios de clonaje únicos (MCS) (“poly-linker”)

MCS (Multi Cloning Site)

(polylinker)

MCS de pUC18

MCS de pUC19

MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa.

pUC Plac O N-lacZ pUC Plac O N-lacZ XGal IPTG

pUC Plac O N-lacZ pUC Plac O N-lacZ XGal IPTG

Inductor IPTG Allolactosa Isopropil b D tiogalctósido INDUCTOR no hidrolizable

Ensayo de b-galactosidasa X-gal

MCS (polylinker) en secuencia codificante para el fragmento N-terminal de la -galactosidasa. Selección de plásmidos con inserto: colonias blancas en placas con IPTG y X-Gal.

+ X-gal + X-gal Colonias blancas Colonias azules

Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos) + IPTG Animación> clonación / clonación (vectores plasmídicos)

+ inserto - inserto

Vectores lanzadera Shuttle