Curso Espectrometría de masas, Electrospray Trampa Iónica y Maldi-Tof UNIVERSIDAD FRANCISCO DE VITORIA Alberto Jorge García Laboratorio de Proteómica Centro de Biología Molecular Severo Ochoa Universidad Autónoma de Madrid-CSIC

Oferta del Servicio de Proteómica www2.cbm.uam.es/proteomica Análisis mediante Espectrometría de Masas Identificación sistemática de proteínas presentes en las bases de datos a partir de geles La Síntesis de Péptidos es un servicio independiente

Identificación Proteína Identificación Péptido Proteómica: Péptidos Proteoma BASE DE DATOS Fragmentos BASE DE DATOS Proteína Identificación Péptido

Servicio de “Proteómica” Digestión manual en gel Análisis mediante MALDI-TOF: Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) Análisis mediante LC-ESI-IT Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

Requisitos para la preparación de geles Reactivos Manipulación Frescos, alto grado de pureza. Muy cuidadosa, queratinas, recipientes de vidrio Precauciones en la preparación de la muestra Confección del gel Lo más cercano posible a la entrega de la muestra STD no preteñidos, no coloreados, no recombinantes. En cantidades conocidas y MW conocidos No admitimos bandas ó spot recortados. Gel completo

Requisitos para la preparación de geles Diseño del gel (monodimensional). Usuario Minimizar el tamaño del carril para mejorar la razón proteína:gel Optimizar la resolución y enriquecer para muestras muy complejas Geles 2 D (bidimensionales) Incluido en la oferta de Servicio Es crítica la preparación de la muestra por parte del usuario (Precipitación con acetona)

Tinción de geles Tinción Coomassie Tinción con plata (no recomendada) Coomassie 0.2%/metanol 50%/10%acético. Fresco Coomassie Coloidal, mayor contraste No fijar con etanol, se forma acetato de etilo Sensibilidad: 0.1 mg, Cuantitativo Prácticamente nunca interfiere con la digestión Tinción con plata (no recomendada) Sensibilidad: 1-10 ng, No es cuantitativa Alta variedad en los protocolos de tinción Interfiere con la digestión Aumenta la necesidad de concentración de proteína, bajo rendimiento y alto nivel de contaminantes BUSCAR REFERENCIAS DE PROBLEMAS CON LA PLATA

Tinción de geles Tinción fluorescente (mono ó 2 D) Sensibilidad: Igual ó mayor a la plata Variedad de tinciones (SYPRO Ruby, SYPRO Orange, SYPRO Red, Deep Purple…) No interfiere con la digestión La fluorescencia se puede medir en el Typhoon y recortar las bandas en un transiluminador UV (300 nm) Disponible en el Servicio

Digestión “in situ” de geles Procedimiento adaptado de Mann y cols. Con variaciones entre coomassie y plata. Control interno de cada gel digiriendo std de pm (descarta problemas atribuibles a la preparación/tinción del gel) Control externo con bandas/spots de geles ya procesados (descarta problemas atribuibles al proceso de digestión y preparación de muestra para MS)

Servicio de “Proteómica” Digestión manual en gel Análisis mediante MALDI-TOF: Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) Análisis mediante LC-ESI-IT Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

Espectro de masas MALDI-TOF

Resultados búsqueda en Mascot

Asignación de péptidos en el mapa de MALDI

Las masas provienen de queratinas y autoproteolisis Aspecto de un mapa cuando no hay digestión Las masas provienen de queratinas y autoproteolisis de tripsina

Mapa típico de digestión de queratinas Contaminación por queratinas dentro del gel

Sypro Rubi vs Plata STD PM Picomoles 2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1 2 1 0.5 0.25 0.1 Gel Sypro después de cortar Gel plata Gel Sypro

Sypro Rubi vs Plata STD 45 kDa 2 picomoles (88 ng) 17 péptidos Sypro Péptidos de Ovalbúmina T 8 péptidos Plata T T

Sypro Rubi vs Plata STD 45 kDa 500 fmoles (22ng) 10 péptidos Péptidos de Ovalbúmina M T T Plata 2 péptidos T T T ?

Sypro Rubi vs Plata STD 45 kDa 250 fmoles (11 ng) 11 péptidos Sypro Péptidos de Ovalbúmina T T M T Plata T 3 péptidos M T T

Identificación mediante PMF Tres niveles de preparación de muestras: Sensibilidad normal: método estándar en placa de acero inoxidable (automatizable) Alta sensibilidad: método “anchorchip” con matriz HCCA y cristalización homogénea de Bruker (automatizable) Muy alta sensibilidad: método “anchorchip” con matriz DHB y cristalización heterogénea (no automatizable) Siempre trabajamos con este método

Identificación mediante PMF Métodos de calibración: Externa próxima, para búsquedas en DB con 100-150 ppm. Los espectros se adquieren con esta calibración Mediante “zonas prohibidas” (*) para búsquedas con 50-100 ppm. Se aplica a la lista de masas obtenida por calibración externa Interna de forma manual, mediante macro ó software (*) para búsquedas con 30-50 ppm Motores de búsqueda: Internet (Mascot, Profound) * Campillo, Martín and Vázquez

Identificación mediante PMF Causas por las que no se identifica una proteína Mapa con un nº insuficiente de péptidos Mezcla de proteínas Proteína no presente en DB Alto nivel de contaminación Modo en el que se genera la lista de masas

Servicio de “Proteómica” Digestión manual en gel Análisis mediante MALDI-TOF: Obtención del mapa peptídico e identificación mediante huella peptídica (PMF) Análisis mediante LC-ESI-IT Buen mapa con mezcla de proteínas: Exclusión dinámica (DE), búsqueda en DB mediante TurboSequest Mapa pobre ó interés en uno ó varios péptidos determinados: Monitorización de iones sencillos (SIM), búsqueda en DB por Tsequest ó confirmación mediante predicción teórica de fragmentación

Identificación de péptidos presentes en DB mediante LC-MS/MS ESI-IT Alta sensibilidad en modo “full scan”: Exclusión dinámica (DE), 100 fmoles para un digerido en solución de estándar de BSA Muy alta sensibilidad en modo SIM: “Monitorización de iones sencillos”, 1-10 fmoles para estándar de BSA

Exclusión Dinámica (Triple-play)

Secuenciación de especies individuales en mezclas de péptidos 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Intensidad Relativa 704.5 1078.3 851.3 394.3 1177.3 295.2 1021.3 463.5 764.3 589.5 964.3 1325.0 V D F W S L G MFVGGLSWDTSKK M MF 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Intensidad Relativa 736.3 655.3 817.3 1082.7 A 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z 20 40 60 80 100 Intensidad Relativa 656.1 543.2 767.1 429.1 932.2 881.2 378.0 204.0 1106.1 1031.1 333.1 541.0 DY V N I L Y P Q 769.2 279.0 PQ E YDVYLINPQGK YD 735 736 737 738 739 m/z 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 736.3 736.7 737.2 654 655 656 657 658 655.2 655.6 656.2 z = +2 M = 1470.6 M = 1308.4 B C

Análisis mediante Espectrometría de Masas Análisis empleando MALDI-TOF Muestras preparadas por usuario (incluye portas y matriz) Muestras preparadas por el Servicio Análisis empleando LC-ESI-IT de fracciones de péptidos provenientes de HPLC preparadas por usuario

Equipos disponibles Un espectrómetro de masas tipo MALDI-TOF, modelo Autoflex de Bruker, equipado con reflector Un espectrómetro de masas de trampa iónica modelo LCQ Classic de Thermo Finnigan, equipado con sistemas de ionización de nanospray y microspray de fabricación propia, acoplado a una HPLC Agilent 1100 con restrictor de flujo inteligente (cedido en mayo 04 por un año) Interface “metal needle kit” para el acoplamiento LC-ESI-IT y columna RP de 180 mm, flujos de 1,5 a 2 ml/m

Procedimiento de trabajo Recepción y control de muestras Aviso previo a la entrega de geles Escaneo del gel, Confección de ficha de usuario, Instrucciones del trabajo a realizar Análisis Digestión manual en gel Obtención del mapa peptídico mediante MALDI-TOF Análisis mediante LC-ESI-IT (centrado en Proteómica)

Personal del Servicio de Proteómica Rosana Rogado: Laboral contratado temporal (CSIC), Ayudante de Investigación y Laboratorio Alberto Jorge: Laboral fijo (CSIC), Técnico de Investigación y Laboratorio Yolanda Núñez: Funcionaria. Técnico Especialista de Grado Medio Anabel Marina: Laboral interino (CSIC), Titulado Técnico nivel 2