Exploración del genoma de cáncer en plasma: Detección de aberraciones del número de copias relacionadas con el tumor, variantes de nucleótido único y heterogeneidad tumoral mediante la secuenciación masiva en paralelo K.C.A. Chan, P. Jiang, Y.W.L. Zheng, G.J.W. Liao, H. Sun, J. Wong, S.S.N. Siu, W.C. Chan, S.L. Chan, A.T.C. Chan, P.B.S. Lai, R.W.K. Chiu e Y.M.D. Lo Enero de 2013 www.clinchem.org/content/59/1/211.full © Copyright 2013 by the American Association for Clinical Chemistry

Introducción ADN del tumor en plasma Presente en pacientes con cáncer Detectado mediante mutaciones, cambios de metilación de ADN y ácidos nucleicos virales Estudios previos basados típicamente en 1 marcador de ácido nucleico o un número reducido de estos marcadores Nuevo enfoque Secuenciación shotgun de ADN Exploración del genoma completo

Introducción Secuenciación shotgun de ADN en plasma Basado en secuenciación de ADN masiva en paralelo Secuenciación aleatoria de millones a miles de millones de moléculas de ADN en plasma Requiere amplio soporte bioinformático Método similar usado anteriormente para diagnóstico prenatal no invasivo

Pregunta 1 ¿Qué tipos de aberraciones moleculares relacionadas con el tumor pueden detectarse en el plasma de pacientes con cáncer?

Materiales y métodos Muestras: Secuenciación de ADN masiva en paralelo 4 pacientes con carcinoma hepatocelular (HCC) 4 pacientes con infección crónica de hepatitis B sin HCC 1 paciente con cáncer sincrónico de mama y ovarios 16 sujetos de control sanos Secuenciación de ADN masiva en paralelo Realizada en ADN de plasma, tejidos tumorales y de capa leucocitaria Concentraciones fraccionales de ADN de tumor en plasma Medido al sumar los recuentos alélicos de polimorfismos de nucleótido único que presentan pérdidas alélicas en tumores

Materiales y métodos Aberraciones del número de copias: Genoma dividido aproximadamente en 3,000 ventanas de 1Mb cada una Comparación de cada ventana en cada paciente con cáncer y portador de hepatitis B crónica con la ventana correspondiente de los 16 controles Variantes de nucleótido único (SNV) Comparación de datos de secuenciación de ADN de capa leucocitaria y tejidos tumorales del mismo paciente Elaboración de SNV relacionadas con el tumor; es decir, mutaciones puntuales Búsqueda de dichas SNV relacionadas con el tumor en los datos de secuenciación del ADN en plasma del mismo paciente

Pregunta 2 ¿Qué procedimiento estadístico puede usarse para detectar aberraciones del número de copias en el plasma de pacientes con cáncer?

Resultados principales Figura 1. Aberraciones del número de copias en el tumor (círculo más interno), plasma anterior a la cirugía (círculo medio) y plasma posterior a la cirugía (círculo mas externo) de uno de los pacientes con HCC. Nótese que el plasma anterior a la cirugía contiene los patrones de ganancias (verde) y perdidas (rojo) del número de copias del tumor

Resultados principales Figura 2. Análisis del número de copias en el plasma de un portador de hepatitis B crónica sin HCC. Nótese la sorprendente diferencia entre estos resultados y aquellos del plasma anterior a la cirugía del paciente con HCC que se observa en la figura 1.

Resultados principales Aberraciones del número de copias relacionadas con el tumor en plasma Se asociaron tumores más grandes con mayores concentraciones fraccionales de ADN de tumor en plasma Se detectaron más aberraciones en pacientes con tumores más grandes Las ganancias de 2 copias se detectaron con mayor facilidad que las ganancias de 1 copia y las pérdidas de 1 copia Las concentraciones fraccionales de ADN tumoral en plasma disminuyeron después de la extracción quirúrgica de HCC

Resultados principales Aplicaciones en escenarios oncológicos complejos El plasma recibe el ADN de tumores de múltiples sitios, que incluyen varios tipos de tumores La contribución de cada sitio y tipo de tumor puede medirse por secuenciación shotgun de ADN en plasma Útil para el control no invasivo de heterogeneidad tumoral (ver Editorial por Swanton. doi:10.1373/clinchem.2012.197053)

Resultados principales B A Carcinoma ductal infiltrante de 3 cm en la mama izquierda Tumor ovárico derecho de 12 cm Tumor ovárico derecho de 6 cm Figura 3. Análisis del número de copias en el plasma del paciente con cáncer sincrónico bilateral de ovarios y de mama. (A) muestra las ubicaciones de los tumores. (B) muestra las aberraciones del número de copias en la mama (círculo más interno), una región del cáncer de ovarios (segundo círculo desde el interior), plasma anterior a la cirugía (tercer círculo desde el interior) y plasma posterior a la cirugía (círculo más externo). Nótese que el plasma anterior a la cirugía contiene el compuesto de patrones de ganancias (verde) y pérdidas (rojo) del número de copias de tumores de mama y ovarios. Las regiones genómicas que contienen las aberraciones del número de copias específicas para el cáncer de mama (marcado por un cuadrángulo) o el cáncer de ovario (marcado por una flecha) pueden usarse para medir el ADN del tumor en plasma que aportó cada tumor.

Resultados principales Carcinoma ductal infiltrante de 3 cm en la mama izquierda Tumor ovárico derecho de 12 cm A Tumor ovárico derecho de 6 cm Clase de SNV Figura 3. Contribución de las SNV asociadas con diferentes regiones del cancer de ovario en plasma. A, B, C y D representan las SNV presentes en solo una de las 4 regiones muestreadas. AB representa las SNV presentes en ambas regiones A y B. CD representa las SNV presentes en ambas regiones C y D. ABCD representa las SNV presentes en las 4 regiones. Los porcentajes indican la proporción del ADN en plasma que aportó cada clase de SNV.

Pregunta 3 ¿Cuáles son las ventajas y las desventajas de la detección de las aberraciones del número de copias relacionadas con el tumor en comparación con las variantes de nucleótido único?

Conclusiones La secuenciación shotgun de ADN en plasma en pacientes con cáncer permite lograr un perfil genómico completo de las aberraciones genómicas relacionadas con el cáncer Esta tecnología permite la detección del tumor, el control en serie, el pronóstico y el análisis de heterogeneidad tumoral Es necesaria la validación en más casos y más tipos de tumores

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