Dra. Esther Z Vega Universidad de Puerto Rico Humacao Purificación de DNA Dra. Esther Z Vega Universidad de Puerto Rico Humacao

Resumen DNA total DNA de plasmidio DNA de fagos

Aislamiento de DNA de bacteria Las bacterias se cultivan en medio favorable a temperatura óptima Se lisan las células y se libera el contenido Tratamiento del extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA Se concentra la solución de DNA

DNA Purification > Total Cell

Crecimiento de la bacteria Crecimiento de medio líquido Medio definido Medio complejo Crecimiento en medio sólido

Monitoreo del crecimiento Growth can be monitored by optical density

Monitoreo del crecimiento Growth can be monitored by optical density

Separación de células Colecta de células Centrifugación

Monitoreo del crecimiento Preparación del extracto celular Las células deben lisarse para liberar el DNA Métodos Físicos Fuerza mecánica es aplicada para romper la pared y la membrana Mortero, sonicación Métodos Químicos Ataque químico a la pared y membrana celular Pared- lisozima, EDTA o ambos Membrana- detergente (SDS)

Lisis celular

Rompimiento de la pared La lisozima digiere los polisacáridos, componentes estructurales de la pared EDTA (tetraacetato de etilenediamina) enlaza iones de magnesio esenciales en preservar la estructura de la célula e inhibe las enzimas que pueden degradar el DNA

Rompimiento de la membrana SDS es un detergente que remueve las moléculas de lípidos

DNA Purification > Total Cell > Breaking Cell

Centrifuge removes insoluble cell debris DNA Purification > Total Cell Centrifuge removes insoluble cell debris

Purificación del DNA Además del DNA, todavía se encuentran una gran cantidad de proteínas y de RNA La remoción de éstas es importante para evitar interferencia en el análisis

Remoción de proteínas y RNA Extracción orgánica Adición de fenol ó fenol/cloroformo Se precipitan las proteínas; formación de una capa blanca en la interfase entre la capa orgánica y la acuosa Se remueve la solución acuosa

DNA Purification > Total Cell > Purification Organic Extraction

Extracción orgánica ¿Qué tal si hay un exceso de proteínas? Se repiten las extracciones con fenol No favorable; destrucción del DNA con el movimiento Rompimiento con proteasa antes de la extracción Pronasa o proteinasa K

Extracción orgánica Parte del mRNA es removido con el tratamiento a fenol. El remanente del RNA puede ser digerido con ribonucleasas (si es necesario).

DNA Purification > Total Cell Concentration of DNA

Extracción por Silica Guanidium thiocyanate Desnaturaliza el material que no es DNA Hace que el DNA se enlace a las partículas de silica Se añade silica directamente o la muestra se pasa por una columna de silica Remoción de DNA al añadir agua

DNA Purification > Total Cell > Purification Purificación de DNA con partículas de silica

Extracción de DNA de otros tipos de células Células vegetales: alto contenido de carbohidratos Lisozima no tienen efecto Se añade CTAB (cetylmethylammonium); se une a los ácidos nucléicos y los precipita Se centrifuga y se remueve el sobrenadante Células animales: no tienen pared, lisan con SDS

Purification of Plant DNA DNA Purification > Total Cell Purification of Plant DNA

DNA de plasmidio Se crece la bacteria y se colecta Se rompen las células y se libera el contenido Se trata el extracto celular para remover todos los componentes excepto el DNA de plasmidio Se concentra la solución de DNA

DNA de plasmidio Separación basada en diferencias entre el plasmidio y el DNA bacterial tamaño- plasmidios son mucho más pequeños

Separación por tamaño En orden de maximar las diferencias, rompimiento mínimo del DNA bacterial Cuando el rompimiento es mínimo, el DNA formará parte del debris celular Rompimiento mínimo se logra utilizando técnicas de rompimiento suave

Rompimiento suave de la célula Tratamiento con lisozima y EDTA en presencia de sucrosa evita el rompimiento inmediato Al formar esferoplastos, la célula puede lizarse con la adición de detergentes no-íonicos

DNA Purification > Plasmid DNA

Separación basado en conformación Separación por el ¨superenrollamiento¨de pequeños plasmidios circulares

Separación basada en conformación Rango de pH más estrecho cuando el DNA ¨superenrrollado¨es desnaturalizado y el DNA regular no. Se usa un lisado claro Al añadir base; DNA regular es desnaturalizado Al añadir ácido; DNA regular es una masa ¨enredada¨ El DNA ¨enredado¨es ¨pellet¨

DNA Purification > Plasmid DNA

Separación basado en conformación DNA ¨superenrrollado¨ también puede ser separado del DNA regular utilizando bromuro de etidio en asociación con un gradiente de densidad con cloruro de cesio (CsCl)

Separación basado en conformación Bromuro de etidio se enlaza a DNA normal, pero sólo en cantidad limitada a DNA ¨superenrrollado¨ Este enlazamiento causa un movimiento en la banda de DNA ¨normal¨

DNA Purification > Plasmid DNA

DNA Purification > Plasmid DNA

DNA de fagos El DNA de fagos puede estar fuera de la célula; no hay que comenzar con un extracto celular Al centrifugar el cultivo, la bacteria estará en el pellet y el fago en suspensión La dificultad es obtener una concentración grande de fagos por ml de cultivo

Para obtener títulos altos El fago debe estar en fase lítica Los fagos deben infectar la baceria al m omento justo en el ciclo de crecimiento cI gene keeps phage in lysogenic phase cIts (temperature sensitive) mutants will enter ltic phase at 42 C

Purificación de DNA fagos Los fagos pueden ser precipitados con glicol de polietileno (PEG) Centrifugar. Descartar el sobrenadante. Redisolver. Purificar por gradiente de densidad de CsCl.

www.dpo.uab.edu/~jglinvil/JS572web S572,FL06,MPurifyDNA.pdf