Métodos de estudio de las células

Presentación del tema: "Métodos de estudio de las células"— Transcripción de la presentación:

1 Métodos de estudio de las células
1.-Técnicas para el estudio fisicoquímico: a)Centrifugación b) Cromatografía c) Electroforesis d) Cultivos "in vitro" 2.- Técnicas para el estudio morfológico de la célula. a) Microscopía óptica b) Microscopía electrónica )

2 Técnicas para el estudio fisicoquímico: sirven para conocer la composición y relacionar esta composición con las estructuras celulares. Este tipo de métodos se utilizan para el aislamiento, localización e identificación de las sustancias que constituyen la materia viva. Presentan dos problemas principalmente: Los componentes de un ser vivo se encuentran formando mezclas muy complejas. b) La mayoría de las sustancias que encontramos en los seres vivos son, a su vez, de una gran complejidad. Pensemos, por ejemplo, que una sola de los varios miles de proteínas que contiene una célula puede estar formada por más 5000 aminoácidos. Pasemos a continuación al estudio de cada uno de estos métodos.

3 Esta técnica requiere los siguientes pasos:
A) CENTRIFUGACIÓN Consiste en la separación de los componentes de una mezcla en función de las diferencias entre las velocidades que presentan al someterlos a elevadas aceleraciones (g). Esto se consigue haciendo girar la mezcla en un rotor a un gran número de vueltas por minuto. Los aparatos empleados con este fin se denominan ultracentrífugas. Esta técnica requiere los siguientes pasos: 1) FRACCIONAMIENTO U HOMOGENEIZACIÓN: El material biológico, por ejemplo: un fragmento de tejido del hígado, es triturado para disgregarlo y romper las membranas celulares. La rotura de las membranas deja en libertad los orgánulos celulares y el contenido del hialoplasma. Si la homogeneización se realiza suavemente, los orgánulos permanecerán intactos. Obtendremos así una "papilla" que estará compuesta de restos de membranas, orgánulos celulares, núcleos, moléculas libres y agua. 2) CENTRIFUGACIÓN: Las ultracentrífugas son máquinas que consiguen velocidades de rotación muy elevadas, hasta v/mn. En el interior de estos aparatos se alcanzan grandes aceleraciones que se miden en g (1g=9,8 m/s2). En una ultracentrífuga pueden alcanzarse hasta g. Los materiales biológicos sometidos a estas aceleraciones se desplazan hacia el fondo de los recipientes que los contienen con velocidades que dependen de su masa, de su forma y volumen, y de la naturaleza del medio en el que se realice la centrifugación.

4 Centrifuga

5 B) CROMATOGRAFÍA Se fundamenta en la separación de los componentes de una mezcla por sus diferencias de absorción. Éstas diferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van der Wals que se establecen entre los componentes de la mezcla y una sustancia que actúa de fase estacionaria. Según la naturaleza de la fase estacionaria, tendremos los siguientes tipos de cromatografía: 1)CROMATOGRAFÍA SOBRE PAPEL: Se emplea para la separación de sustancias químicas que presenten propiedades muy parecidas. Se opera de la siguiente manera. Una pequeña cantidad de la mezcla a separar se introduce el borde del papel en una sustancia en la que sean solubles los componentes de la mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazará por capilaridad y los irá arrastrando. Los componentes de la mezcla viajarán más o menos rápido según establezcan fuerzas más o menos grandes con las moléculas del papel. Para observar los componentes ya separados se emplean reacciones coloreadas específicas. 2) CROMATOGRAFÍA DE GASES: El aparato consiste en un serpentín largo y delgado cuyas paredes están impregnadas de un líquido (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentín transportada por un gas. La fase estacionaria retiene más o menos los diferentes componentes de la mezcla. Éstos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustión, lo que aumenta la conductividad eléctrica del detector. Este método tiene la ventaja de necesitar pequeñísimas cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias muy parecidas químicamente; por ejemplo: ácidos grasos, azúcares u hormonas.

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7 C) ELECTROFORESIS En este método, la mezcla a separar se deposita en una cubeta sobre un soporte de tipo poroso (acetato de celulosa o también gel de almidón). A continuación se establece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte. Las sustancias que componen la mezcla se desplazarán en función de su carga eléctrica. Naturalmente este método se empleará con sustancias que presenten cargas eléctricas (proteínas y ácidos nucléicos)

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9 D) CULTIVOS IN VITRO Estos métodos nos van a permitir mantener líneas celulares en el exterior de un organismo en condiciones favorables a su multiplicación. La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biológico y su estandarización. Las células extraídas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones físicas y químicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos períodos de tiempo.

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11 Microscopio Instrumento óptico para ampliar la imagen de objetos o seres, o de detalles de estos, tan pequeños que no se pueden ver a simple vista; consta de un sistema de lentes de gran aumento.

12 .-Aumento y resolución Los términos aumento y resolución deben ser bien conocidos por todo usuario del microscopio. El mecanismo mediante el cual se produce este fenómeno ha sido estudiado por siglos y se explica mediante leyes de la física. Considerar únicamente el aumento no es suficiente para sacar el mejor partido del microscopio, pues otro factor, la resolución, determina lo que se verá. .-Aumento El poder de aumento de una lente está determinado por el grado de curvatura de su superficie y la distancia focal. En las lentes convexas mientras mayor sea la curvatura, menor será la distancia focal y mayor será el aumento. Se ha enunciado anteriormente que el microscopio compuesto aumenta en dos etapas y puesto que una sola lente no es suficiente se deben colocar varias lentes una detrás de la otra, potenciando de esta manera el poder de aumento. El primer juego de lentes, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo y el segundo juego, cercano al ojo del observador se denomina ocular (11). Cada sistema de lentes es capaz de producir una imagen aumentada cuyo valor se enuncia con la letra x, así que 10x significa que la imagen está aumentada 10 veces. Para conocer en el microscopio compuesto el aumento definitivo de una imagen se aplica la siguiente fórmula: AUMENTO TOTAL: Aumento del objetivo x Aumento del ocular Aunque esta fórmula básica permite obtener el aumento total de una imagen, con las técnicas de fotografía clásica o fotografía digital y el uso de software de procesamiento de imágenes es posible lograr un aumento suplementario. Para obtener el aumento definitivo habría que considerar los factores de ampliación que se realizan en la pantalla del computador (para luego imprimirla) o al copiar la foto a papel mediante la técnica de fotografía clásica. El poder de aumento de un sistema óptico tiene sus límites y el aumentar las imágenes acarrea pérdida de información o detalles del objeto estudiado. Esto puede ser resuelto mediante otro principio: La resolución. Con el microscopio compuesto clásico es posible alcanzar un aumento máximo de 1000x. Esta limitación ha sido resuelta empleando un haz de electrones en lugar de un rayo de luz visible, y se abrió así una nueva era con la microscopía electrónica aplicada al estudio morfológico.

13 .-Resolución Es la capacidad que tiene un sistema óptico de aislar dos puntos que se encuentran muy próximos entre sí, de manera que se puedan ver individualizados uno del otro (14). La riqueza de detalles que puede ser observada al microscopio depende de la habilidad de este para hacer que los puntos del objeto que están muy cercanos aparezcan en la imagen como puntos separados. Mientras más corta sea la distancia entre esos puntos del objeto, más finos serán los detalles. La distancia entre esos dos puntos se conoce como Límite de Resolución, el cual es también referido como el Poder de Resolución y puede ser utilizada como un indicador del rendimiento del microscopio. Esto se puede comparar vagamente con algunos aspectos de la informática, el tamaño del pixel por ejemplo; mientras más pequeño sea el tamaño, mayor será la cantidad de detalles de la imagen digital. Límites de Resolución aproximados de algunos sistemas ópticos: • Ojo humano: 0,2 mm. • Microscopio Fotónico: 0,2 µm. • Microscopio electrónico: 0,2 nm.

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15 El Microscopio óptico  El microscopio óptico tiene un límite resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm ).  Este límite se debe a la longitud de onda de la luz  ( µm). Las células observadas bajo el microscopio óptico pueden estar vivas o fijadas y teñidas.

16 El microscopio electrónico de transmisión (MET)
El microscopio electrónico de transmisión  (MET) tiene un límite de resolución de cerca de 2 nm.  Esto es debido a limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra.  Un MET mira a réplicas de células muertas , después de haber sido fijadas y teñidas  con íones de metales pesados.  Los electrones son dispersados cuando pasan a través de una fina sección  del espécimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen  sobre una pantalla fluorescente. 

17 El microscopio electrónico de barrido (MEB)
El microscopio electrónico de barrido (MEB) también tiene un límite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite mirar a células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Con esta técnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espécimen.