INTRODUCCIÓN Enfermedad de Chagas.

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2 INTRODUCCIÓN Enfermedad de Chagas.
La infección congénita puede producirse por la vía transplacental, causando la enfermedad de Chagas congénita. La arquitectura de la placenta humana permite una asociación entre la circulación materna y fetal.

3 Arquitectura placentaria

4 El STB es la barrera materno-fetal más importante y se forma por la fusión de las células del CTB.
El STB sufre daños, se produce una perturbación en su renovación, esto se asocia a embarazos anormales. Estos daños pueden ser causados por parásitos protozoarios como Plasmodium sp y Tripanosoma cruzi. STB es muy importante en el desarrollo fetal, una alteración del mismo puede originar bajo peso en los RN, partos prematuros o abortos.

5 Hipótesis planteada Propuesta
T. cruzi afecta la proliferación del CTB y/o diferenciación a STB. Propuesta Analizar la proliferación del CTB en vellosidades coriónicas denudadas de su sinciciotrofoblasto en presencia de T.cruzi. Determinar la influencia del parásito en la maduración de CTB a STB, midiendo en los medios de cultivo la producción de hCG, FAP y expresión de eNOS y FAP.

6 MATERIALES Y MÉTODOS 1 2 PLACENTAS:
n=3, serología negativa para infecciones. Se obtuvieron explantos de vellosidades coriónicas libres de membrana y se utilizaron para cultivos. PARÁSITOS: Tripomastigotes de T. cruzi de las cepas Tulahuen y Lucky. 2

7 3 CULTIVO DE EXPLANTOS: Denudados del STB con tripsina al 0,125% y se co-cultivaron con 106 tripomastigotes de la cepa Tulahuen y Lucky; en medio RPMI, pH 7,35, SBF al 10% y antibióticos, en atmósfera al 5% CO2 a 37ºC por 72 hs. Control: co-cultivos de explantos denudados sin infectar. ANÁLISIS DE PROLIFERACIÓN DEL CTB Y RE- SINCIALIZACIÓN POR INMUNOHISTOQUÍMICA: Células de CTB fueron localizadas por la localización de Cadherina E. Zonas diferenciación a STB fueron localizadas por la expresión de eNOS y FAP. La proliferación del CTB fue determinada por Ki67. 4

8 5 6 ANÁLISIS MORFOMÉTRICO:
Se obtuvo el porcentaje de área de tejido ocupada por células de CTB relacionadas con el área total analizada. Las mediciones se realizaron en 10 imágenes digitales por corte. Se contaron los núcleos CTB positivos para el marcador Ki67. DETERMINACIÓN DE -hCG: Para determinar la diferenciación de CTB a STB se midió la producción de la hormona -hCG, mediante el método de quimioluminiscencia inmunométrico. 6

9 7 8 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ESPECÍFICA DE FAP:
Los medios se precalentaron a 60ºC durante 15 minutos. Luego se determinó la actividad de la FAP siguiendo la técnica de Messer, usando como sustrato p-nitrofenol fosfato. La cuantificación de proteínas se realizó según Lowry. ANÁLISIS ESTADÍSTICO: Diferencias entre grupos fueron testeadas usados Student’s test. Una probabilidad de p<0,05 fue considerada estadísticamente significativo. 8

10 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INMUNOHISTOQUÍMICA PARA CADHERINA E – A) Co-cultivo con cepa Lucky. B) Co-cultivo con cepa Tulahuen. La flecha señala los grupos de CTB.

11 H/E – C) Co-cultivo con cepa Lucky. D) Co-cultivo con cepa Tulahuen
H/E – C) Co-cultivo con cepa Lucky. D) Co-cultivo con cepa Tulahuen. La flecha señala los grupos de células CTB.

12 Área ocupada por grupos de CTB m2
TABLA 1 Tipo de cultivo Área total medida m2 Área ocupada por grupos de CTB m2 % del área ocupada por grupos de CTB Explantos – Tulahuen 51412,78 2381,29 4,63% Explantos - Lucky 65662,79 184,33 0,28% Explantos sin T. cruzi 48587,62 1572,13 3,23% TABLA 2 Tipo de cultivo Área total medida m2 Número de núcleos de CTB en proliferación (Ki67 +) Explantos – Tulahuen 53660,59 4 Explantos - Lucky 52479,86 18 Explantos sin T. cruzi 60749,29 10

13 Inmunohistoquímica para detectar la expresión de Ki67 – E) Co-cultivo con cepa Lucky. F) Co-cultivo con cepa Tulahuen. La flecha señala los grupos de células CTB. Fechas: núcleos marcados positivamente.

14 Inmunohistoquímica para la marcación de FAP – G) Co-cultivo con cepa Tulahuen. H) Co-cultivo con cepa Lucky.

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16 CONCLUSIÓN Los resultados muestran que el T. cruzi modifica el recambio del trofoblasto in vitro en un modelo de vellosidades coriónicas denudadas de su capa sincicial. El efecto de T. cruzi sobre el trofoblasto es dependiente de la cepa y puede reflejar la variedad de formas clínicas que se han descripto de la enfermedad congénita de Chagas. Los resultados pueden explicar algunos de los signos clínicos que están asociados al Chagas congénito, tales como, bajo peso al nacer, restricción del crecimiento fetal y embarazos prematuros. Es necesario realizar más estudios para establecer el exacto mecanismo por el cual el T. cruzi altera el recambio del trofoblasto.

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