LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALES WNT POR INHIBICIÓN EPIGENÉTICA DE SUS GENES REPRESORES SE ASOCIA AL PRONÓSTICO DE LA LMA.

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1 LA ACTIVACIÓN DE LA VÍA DE SEÑALES WNT POR INHIBICIÓN EPIGENÉTICA DE SUS GENES REPRESORES SE ASOCIA AL PRONÓSTICO DE LA LMA

2 Vía Wnt  La vía de señalización Wnt es una de las rutas que comunica la membrana con el núcleo celular.  Desarrollo y diferenciación de tejidos y órganos en embriones.  Mecanismos de auto-renovación, diferenciación y proliferación de las células madre hematopoyéticas.  El genoma humano tiene al menos 20 genes que codifican para proteínas Wnt: glipoproteínas secretadas que regulan los procesos implicados en el desarrollo y son las que inician la cascada de señales.

3 ACTIVAINACTIVA Vía Wnt CICLINA D1 / C-Myc

4 Gen Enfermedad Referencia WNT1 Cáncer de mama murino Nurses & Varnus 1982 APC Cáncer de colon Polakis, 1997 AXINA-1 Carcinoma hepotocelular Clevers, 2000 Β-catenina Cáncer de colon y melanomas Su, 1993 & Rubinfeld 1993 LRP5 Defectos de la densidad ósea Boyden et al. 2002 Axina 2 Formación de los dientes Lammi et al. 2004 Vía Wnt La vía Wnt se puede encontrar desregulada por alteración de los componentes de la vía:

5 Vía Wnt La vía Wnt en LMA Constitutive activation of the Wnt/b-catenin signalling pathway in acute myeloid leukaemia. Simon et al. Oncogene. 2005 Translocation products in acute myeloid leukemia activate the Wnt signalling pathway in hematopoietic cells. Müller-Tidow et al. Mol Cell Biology. 2005 Flt3 tandem deplicarion mutations cooperate with Wnt signalling in leukemic signal transduction. Tickenbrock et al. Blood. 2006

6 FZD3 WNT16 TCF1/LEF1 Ciclina-D1 RT-PCR CUANTITATIVA EN TIEMPO REAL Hdpr1 PCR ESPECÍFICA DE METILACION CON ADN TRATADO CON BISULFITO Dkk 1, 2, 3, y 4 Wif1 Inhibidores / Activadores Wnt Román-Gómez et al. Blood 2007 Líneas celulares + 261 LLA Regulación epigenética de vía Wnt + Activación constitutiva de vía Wnt sFRPs 1,2,3,4 y 5 20 LLA + 32 LPA + 50 LMA Metilación Wif: factor pronostico independiente en LPA Chim et al. Leukemia 2006

7 Hipótesis La activación de la vía Wnt ocurre en muchos tipo de cáncer, siendo el cáncer de colon el mejor estudiado. Esta desregulación ocurre por la alteración de los componentes de la vía Wnt o sus genes antagonistas. En la LLA uno de los mecanismos que alteran los genes antagonistas de la vía Wnt es la metilación. En la LMA se ha demostrado que la vía Wnt se encuentra activada de forma constitutiva. Nos proponemos investigar si la metilación de algunos de los genes antagonistas es responsable en parte de esta activación.

8 Objetivos  Determinar si los genes represores-Wnt se inactivan por metilación en la LMA.  Determinar si dicha metilación activa la vía de señales Wnt.  Determinar el papel de la metilación en la patogénesis y pronóstico de la LMA.

9 Material y Métodos Pacientes  184  184 LMA al diagnóstico  110 hombres y 74 mujeres  Mediana de edad: 60 años (extremos 16 – 92)  Mediana de leucocitos: 9.4 x 10 9 /L (extremos 0.6 – 620)  Clasificación FAB: 14 M0; 45 M1; 48 M2; 26 M4; 27 M5; 18 M6; 2 M7; 4 Otros  164 casos citogenética valorable: 15 grupo riesgo citogenético FAVORABLE 111 grupo riesgo citogenético INTERMEDIO 38 grupo riesgo citogenético ADVERSO

10 Material y Métodos Modificación química del ADN NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico MSP-PCR Primers específicos metilación: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green 55ºC o/n Control negativo Control positivo Niveles de expresión Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green

11 Material y Métodos Sybr Green

12 Material y Métodos Modificación química del ADN NaOH + Hidroquinona + Bisulfito sódico MSP-PCR Primers específicos metilación: sFRP1, sFRP2, sFRP4, sFRP5, DKK1 y DKK3 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green 55ºC o/n Control negativo Control positivo Niveles de expresión Primers específicos: CICLINAD1, TCF1 y LEF1 Plataforma LIGHTCYCLER Sybr Green

13 Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA

14 Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA

15 Resultados I. Porcentaje de metilación de los genes antagonistas de la vía Wnt Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA 64% La metilación aberrante es un evento frecuente en la LMA: el 64% de los pacientes presentan algún gen metilado

16 Resultados II. Sobre-expresión de los genes de la vía Wnt La sobre-expresión de genes de vía Wnt ocurre entre los pacientes con fenotipo metilador n=370 gen1-6 gen ↓ TCF1917 ↑ TCF1011 n=400 gen1-6 gen ↓ CD11022 ↑ CD108 n=310 gen1-6 gen ↓ LEF1518 ↑ LEF108 Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo metilador 0.002 0.014 0.01

17 Resultados III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt con las características clínico-biológicas de los pacientes sFRP1sFRP2sFRP4sFRP5DKK1DKK3 p valor -+-+-+-+-+-+ FLT3ITD+62386931964732769318713 58 42n.s NPM1+604068328416802080207525 52 48n.s EDAD n.s > 6061395246982762467338416 59 41 < 6057434852955802070308515 54 46 SEXO n.s Hombre56446159964742664368317 51 49 Mujer63373941964841674268713 65 35 LEUCOS n.s > 10.00061396832964802068328416 59 41 < 10.00057437030964762468328515 54 46 CITOGEN n.s Fav534780201000732767338713 6 7 33 Int58426644973831768328614 58 42 Adv68326337973604068328416 47 53 - + Perfil 0.015

18 Resultados III. Relación de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt con las características clínico-biológicas de los pacientes - + Perfil sFRP1sFRP2sFRP4sFRP5DKK1DKK3 -+-+-+-+-+-+ RC (1º ciclo)52 51565275544653495348 55 48 RC (2º ciclo)8592708384 84 9 3 RESISTENC22 2318222517402027 2035 20 26 MUERTE1722172519020111820 1913 16 23 p valor n.s 0.03 n.s

19 Resultados Serie Total 0.004 0-1 2-6 IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

20 Resultados Serie Total 0.06 0-1 2-6 IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

21 Resultados 0.2 Serie Total 0-1 2-6 IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

22 Resultados SG EDAD< 0.001 FLT3-ITD0.1 NPM10.4 FLT3ITD + NPM10.06 SEXO0.6 LEUCOS > 10.0000.1 FAB0.5 RC1º / RC2º0.6 CITOGENETICA0.008 sFRP10.01 sFRP20.7 sFRP40.1 sFRP50.03 DKK10.8 DKK30.2 Serie Total IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

23 Resultados IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE SLE EDAD< 0.001 FLT3-ITD0.03 NPM10.4 FLT3ITD + NPM10.01 SEXO0.2 LEUCOS > 10.0000.2 FAB0.5 RC1º / RC2º0.3 CITOGENETICA0.008 sFRP10.08 sFRP20.5 sFRP40.1 sFRP50.7 DKK10.6 DKK30.2 Serie Total

24 Resultados SLR EDAD 0.1 FLT3-ITD0.005 NPM10.3 FLT3ITD + NPM10.003 SEXO0.09 LEUCOS > 10.0000.1 FAB0.8 RC1º / RC2º0.5 CITOGENETICA0.1 sFRP10.08 sFRP20.4 sFRP40.8 sFRP50.7 DKK10.3 DKK30.3 Serie Total IV. Papel pronóstico de características clínico-biológicas relevantes en la LMA: ANÁLISIS UNIVARIANTE

25 Resultados 0-1 2-6 SG: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio 0.03 0.5 0.04 0.09 0.8 0.035 IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA

26 Resultados IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA SLE: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio 0-1 2-6 0.05 0.6 0.14 0.04 0.9 0.14

27 Resultados IV.I Papel pronóstico de la metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt en la LMA SLR: Menor 60 años & Cariotipo Intermedio 0-1 2-6 0.15 0.68 0.03 0.9 0.02 0.6

28 Resultados Menor 60 años & Cariotipo Intermedio 0-1 2-6 0.005 IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA

29 Resultados Menor 60 años & Cariotipo Intermedio 0.001 0-1 2-6 IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA

30 Resultados Menor 60 años & Cariotipo Intermedio 0.03 0-1 2-6 IV. Papel pronóstico del perfil de metilación (2-6 genes metilados) de los genes antagonistas de Wnt en la LMA

31 Conclusiones  Los genes antagonistas de la vía Wnt están metilados en la LMA. El 64% de los pacientes presenta algún gen metilado.  Los niveles medios de expresión de los genes de vía Wnt fueron significativamente más alta en los pacientes con fenotipo metilador.  La metilación aberrante de los genes antagonistas de Wnt se asocia a la activación de la Vía Wnt en pacientes con LMA.

32 Conclusiones  La metilación de los genes no se asoció a las características clínico-biológicas de los pacientes. Excepto sFRP5 que se asoció al grupo de riesgo citogenético adverso y a la resistencia tras la inducción.  El fenotipo metilador se asocia al subgrupo de mal pronóstico en los pacientes jóvenes pertenecientes al grupo de riesgo citogenético intermedio.  En el análisis univariante el gen sFRP5 se asocio a un mayor riesgo de recaída.

33 Próximos experimentos Estudio in vitro en 4 líneas celulares de LMA: KASUMI-1: FAB-M2; t (8;21) KG1A: FAB-M6 TPH1: FAB-M5; t (9;11) HL60: FAB-M2 (c-myc) AS METILACIÓN Y EXPRESIÓN DE GENES ANTAGONISTAS AZA EXPRESIÓN DE CD1, TCF1 Y LEF1