DEFERIPRONA Y IDEBENONA RECUPERAN LOS FENOTIPOS DE LA REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH Jose V. Llorens, Sirena.

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1 DEFERIPRONA Y IDEBENONA RECUPERAN LOS FENOTIPOS DE LA REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH Jose V. Llorens, Sirena Soriano, M.J. Martínez, M.D, Moltó Departamento de Genética, Universidad de Valencia

2 Drosophila como modelo de enfermedades humanas
Fácil manejo / Corto ciclo de vida Más de 100 años de genética: genoma mejor anotado > 60% de los genes responsables de enfermedades humanas tienen un ortologo en Drosophila Multiples herramientas mutagénicas / Mutantes disponibles para un gran número de genes Gran conocimiento del sistema nervioso y de su desarrollo

3 Frataxina, una proteína altamente conservada
La Frataxina es una proteina muy conservada a lo largo de la evolución, tanto a nivel de secuencia aminoacídica y en estructura encontrandose desde bacterias a humanos. Bencze et al. 2006

4 Un modelo en Drosophila de AF
cromosoma X La mosca del vinagre tiene un homologo de la proteína frataxina. La frataxina es codificada por el gne homologo a la frataxina, llamado fh que se mapeo en nuestro laboratorio en el cromosoma X. En la figura podemos ver como la frataxina se localiza en la mitocondria, ya que en verde vemos la localización de la proteína de fusión frataxina-GFP, en rojo la tinción de la mitocondria en en la tercera imagen vemos como colocalizan las dos señales A1 A2 A3 Cañizares et al. 2000, Llorens et al. 2007

5 Un modelo en Drosophila de AF
X GAL4 driver (actin-GAL4) Promoter GAL 4 UAS - responder (UAS-fhIR) fh UAS hf actin-GAL4/UAS-fhIR Promoter GAL 4 fh UAS hf

6 Un modelo en Drosophila de AF
control fh-RNAi 2-ΔΔCt qRT PCR fh hf GFP fragment 500 pb 650 pb En nuestro laboratorio se ha desarrollado un modelo basado en la ARN de interferencia en Drosophila. Cuando se expresa el contructo de ARNi en un patrón ubicuo mediante el sistema UAS-GAL4, se observa una reducción del 70% de la expresión de frataxina. Llorens et al. 2007

7 Un modelo en Drosophila de AF
control fh-RNAi 2-ΔΔCt qRT PCR % survivals days control fh-RNAi 100 80 60 40 20 Supervivencia normoxia Nosotros caracterizamos los fenotipos de las moscas mutantes y encontramos que habia una fuerte reducción en la longevidad de estos individuos frente a las moscas control. Llorens et al. 2007

8 Un modelo en Drosophila de AF
control fh-RNAi 2-ΔΔCt qRT PCR % survivals days control fh-RNAi 100 80 60 40 20 Supervivencia normoxia Speed (cm/s) Test escalada normoxia control fh-RNAi Además se observa fuertemente afectada la mobilidad (estudiada mediante test de escalada). Llorens et al. 2007

9 Un modelo en Drosophila de AF
control fh-RNAi 2-ΔΔCt qRT PCR % survivals days control fh-RNAi 100 80 60 40 20 Supervivencia normoxia Speed (cm/s) Test escalada normoxia control fh-RNAi % survivals days control fh-RNAi Supervivencia hiperoxia Debido a que el estrés oxidativo había sido relacionado con la patogenesis de la enfermedad, decidimos mantener a nuestras moscas mutantes bajo condiciones de alto estrés oxidativo situándolas en una atmósfera con O2 al 99.5%. En estas condiciones, la reducción de la longevidad y de la habilidad motora en los mutantes se dramaticamente reducida. De hecho, no pudimos realizar el test de escalada debido a Llorens et al. 2007

10 Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH
control 1 día fh-RNAi 15 días 25 días Actividad aconitasa normoxia Isocitrate dehydrogenase Ciclo de Krebs Posteriormente se midio la actividad de las proteínas del ciclo de Krebs que contienen centros hierro-azufre, la aconitasa y la Succinato deshidrogenasa. En condiciones de un estres oxidativo normal no se observó ninguna diferencia significativa entre el control y el mutante de fh en la actividad de la enzima aconitasa. Llorens et al. 2007

11 Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH
control 1 día fh-RNAi 15 días 25 días Actividad aconitasa normoxia Isocitrate dehydrogenase Ciclo de Krebs control 1 día fh-RNAi 5 días 25 días Actividad SDH normoxia Y tampoco se observón ninguna diferencia en la actividad de SDH en las mismas condiciones entre el control y el mutantea Llorens et al. 2007

12 Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH
control normoxia fh-RNAi hyperoxia Actividad aconitasa *** Isocitrate dehydrogenase Ciclo de Krebs Although there was no difference in aconitase activity in normoxia, there was a significant reduction in aconitase activity in mutant flies in hyperoxia. Llorens et al. 2007

13 Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH
control normoxia fh-RNAi hyperoxia Actividad aconitasa *** Isocitrate dehydrogenase Ciclo de Krebs control normoxia fh-RNAi hyperoxia Actividad SDH However, we couldn’t find any significant difference in succinate dehydrogenase activity in hyperoxia. Llorens et al. 2007

14 Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH
control normoxia fh-RNAi hiperoxia Actividad aconitasa *** control inactivo fh-RNAi activo activo (+ATP) hiperoxia normoxia *** Respiración (Consumo de O2) We also measured the activity of complexes I and II of the electron transport chain but we didn’t find any difference between mutants and controls. We did find a significant reduction of respiration due to the aconitase activity reduction. Llorens et al. 2007

15 Objectivos Probar el efecto de moléculas terapéuticas que dan resultado positivo en ensayos clínicos con pacientes con AF sobre los fenotipos observados en los mutantes de Drosophila. Validar nuestro modelo para realizar el screening de nuevas moléculas terapéuticas para el tratamiento de la AF.

16 Tratamientos de la AF curefa.org
In this graph you can see a summary of the different aproaches that are being tested for the treatment of FA. We decided to use two compounds that are in advanced phases of clinical trials, an antioxidant, idebenone, and an iron chelator, deferiprone. curefa.org

17 Deferiprona Quelante de hierro con permeabilidad de membrana
Transfiere el hierro quelado al aceptor transferrina Atraviesa la barrera hematoencefálica Boddaert et al. 2007 Decrecimiento en la acumulación de hierro en el núcleo dentado en pacientes de AF Mejora neurológica (apreciado por pacientes y familiares, ICARS scores) No hay cambios significativos en parámetros asociados al hierro en sangre Deferiprone is an iron chelator able to cross membranes and to transfer the iron chelated to transferrin. In the clinical trial carried out by Boddaert et al., deferiprone decreased the iron accumulation observed in the dentate nuclei of patients, with no associated significant change in blood-iron parameters. Both patients and relatives reported a neurologic improvement, that was corroborated by a significant improvement in ICARS scores.

18 Idebenona Benzoquinona estructuralmente relacionada con el coenzima Q10 Transportador de electrones en la CTE mejorando la función respiratoria y el metabolismo energético en la mitocondria Antioxidante, inhibe la peroxidación lipídica Idebenone is a benzoquinone structurally related to coenzyme Q10. It can act as electron carrier in the Electron Transport Chain, improving the respiratory function and energy metabolism in mitochondria. It can also act as an antioxidant that inhibits lipid peroxidation. Meier et al. 2009

19 Idebenona Reviewed in Schulz et al. 2009
Several clinical trials have been carried out with idebenone. In this summary you can see that significant improvement of cardiac and of neurological functions have been reported. Reviewed in Schulz et al. 2009

20 Concentrationes testadas Deferiprona: 65 and 163 µM
Idebenona: 7, 15 and 30 µM Comienzo del tratamiento Embriones 0-24h Moscas adultas tras la emersion de la pupa Cepas GAL4 usadas actin-GAL4: expresión ubicua neur-GAL4: expresión en el SNP Experimentos llevados a cabo Longevidad y escalada Actividad aconitasa en hiperoxia -In our mutant flies, we tested 2 concentrations of deferiprone and 3 of idebenone. -We started the treatments at 2 different moments, hatching the embryos on treatment and giving the treatment only to the adult flies. -We directed the reduction of frataxin to the PNS and to the whole organism. -And we performed survival and climbing tests and we measured the aconitase activity in hyperoxia

21 La deferiprona mejora la supervivencia y la habilidad motora de mutantes actin-GAL4 > UAS-fhIR
Deferiprone was administered to the mutant flies and controls at 2 concentrations, 65 and 163μM. With the ubiquitous driver and when embryos are hatched on treatment, lifespan of the mutant flies is significantly improved by the higher concentration of the drug. We performed 2 climbing tests, to adult flies of one week and two weeks of age, after emergency from puparium. In the figure, the controls are in blue, the mutant without drug in light green and for the other 2, the darker the color, the higher concentration of the drug. The higher concentration of Deferiprone significantly improves motor ability of the mutant flies in both cases. However, when deferiprone is added to the adult individuals, no significant differences were found.

22 La deferiprona mejora la supervivencia y la habilidad motora de mutantes neur-GAL4 > UAS-fhIR
-When the reduction of frataxin levels was limited to the PNS by means of the driver neur-GAL4, the higher concentration of deferiprone administered at embryonic stage significantly improves again the climbing ability of the mutant flies in the first and second week after the adult emergency from puparium. - -However, no significant differences were found in the rest of cases with the neur-GAL4 driver.

23 La idebenona mejora la supervivencia y la habilidad motora de mutantes actin-GAL4>UAS-fhIR
In the case of idebenone, when the reduction of frataxin is ubiquous, there is a significant improvement of the lifespan when the treatment is added in embrionic stage and it is the only case in which we found a significant improvement when the treatment was only applied to adult individuals. This positive results were only seen for the 2 lower concentrations of idebenone. In a similar way, only the lower concentration of idebenone significantly improves the climbing ability only in the second week, when embryos are hatched on treatment. No significant difference neither in lifespan nor in climbing was found when the frataxin reduction was directed to the PNS.

24 La idebenona recupera la actividad aconitasa de mutantes actin-GAL4>UAS-fhIR mutants en hiperoxia
-We tested the effect on aconitase activity of Deferiprone and Idebenone administered from embyonic stage. Only the concentrations that give better results in the survival and climbing tests were evaluated. Idebenone but not Deferiprone recovers the aconitase activity. (Although Deferiprone has been related with a loss of aconitase activity (Goncalves et al. 2008), we do not see any significant difference neither in controls nor in mutants.)

25 Ni la Deferiprona ni la Idebenona afectan al sistema de expresión UAS-GAL4
actin-GAL4/UAS-fhIR Promoter GAL 4 fh UAS hf X GAL4 driver (actin-GAL4) UAS responder (UAS-fhIR) -As Dr. Llorens has explained before, in Drosophila, the use of the yeast UAS-GAL4 expression system is very extended. It allows us to control the moment and the tissue in which our construct is expressed. We wanted to check that the improvements observed were really due to the effect of the drugs on the pathological phenotype and no by an interaction with the UAS-GAL4 system. So, we administered the drugs to flies expressing GFP in the whole organism by means of the UAS-GAL4 system, and we measured the GFP fluorescence. No significant differences were found for any of the treatments.

26 La Deferiprona no tiene ningún efecto sobre la expresión del gen fh
En Drosophila, no hay diferencias significativas en la expresión de frataxina tras el tratamiento con Deferiprona. Iron chelation has been related with changes in frataxin expression (Boddaert et al. 2007, Li et al. 2008). So we tested whether deferiprone had an effect on the frataxin expression in control flies, but no significant differences were detected.

27 Conclusiones La Deferiprona y la Idebenona mejoran la supervivencia y la habilidad motora de las moscas mutantes. La Idebenona pero no la Deferiprona recupera la actividad de la enzima aconitasa en hiperoxia. Estas mejoras son debidas a los tratamientos con los medicamentos per se y no al efecto de estos sobre el sistema UAS-GAL4. Los resultados confirman la validez de nuestro modelo en Drosophila de la AF para el desarrollo de screenings farmacológicos de nuevas moléculas con propiedades farmacológicas.

28 Prof. Dr. Mª Dolores Moltó Ruiz Prof. Dr. Mª José Martínez Sebastián
Departament of Genetics Universitat de València Prof. Dr. Mª Dolores Moltó Ruiz Prof. Dr. Mª José Martínez Sebastián Dr. José Vicente Llorens Llorens Sirena Soriano Rodríguez Prof. Dr. Stephan Schneuwly Dr. José Antonio Botella Muñoz Dr. Juan Antonio Navarro Langa Universität Regensburg Lehrstuhl für Entwicklungsbiologie