1 Ensamblado de fragmentos de ADN Grupo 6. 2 ORGANIZACIÓN 1. Background Biológico 2.Modelos 3.Algoritmos.

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1 1 Ensamblado de fragmentos de ADN Grupo 6

2 2 ORGANIZACIÓN 1. Background Biológico 2.Modelos 3.Algoritmos

3 3 BACKGROUND BIOLÓGICO ¿Qué es una secuencia de ADN ? Es un método que nos permite descubrir como es la secuencia del ADN. ¿Qué es la secuenciación ? Es una disposición u ordenamiento de las cuatro bases (A, T, C, G), en la molécula de ADN.

4 4 METODOLOGÍA Genno es igual Genoma Secuenciación a gran escala Herramientas de la bioinformática

5 5 GENOMA Dos métodos de secuenciación principales: WHOLE GENOME SEQUENCING Por lo general utilizado para genomas poco repetitivos (virus, bacterias, moscas) HIERARCHICAL SHOTGUN SEQUENCING Por lo general para genomas con repeticiones (eucariontes en general) Ventajas: -Detecta secuencias repetidas -No tiene problemas de regiones poco representadas 12

6 6 Enzima de restricción de alta frecuencia de corte (1 a 2 kb) Se eligen clones en forma aleatoria DNA TARGET Se introducen fragmentos en vectores Fragmentos desordenados Introducción de1 vector por cada bacterias (clon) Secuenciación y Ensamblado Secuencia de DNA target 1

7 7 YACS Mapeo Físico DNA target (muchas copias) Enzima de restricción de baja frecuencia de corte fragmentos de 10 a 1000 kb Elección al azar de algunas colonias 2

8 8 Se replican Se elige un clon fragmentos cortos (40 kb) Enzima de restricción de alta frecuencia de corte Inclusión de fragmentos en cósmidos Introducción de fragmentos en bacterias Secuenciación de fragmentos pequeños ENSAMBLADO DE SECUENCIAS DE FRAGMENTOS CORTOS

9 9 ENZIMAS DE RESTRICCION

10 10 CASO IDEAL Supongamos que tenemos las siguientes secuencias: ACCGT CGTGC TTAC TACCGT Una posible manera de ensamblarlas : --ACCGT-- ----CGTGC TTAC----- -TACCGT-- TTACCGTGC Las secuencias fueron alineadas ignorando los espacios de las extremidades. Se trata de alinear en la misma columna bases que sean iguales.

11 11 COMPLICACIONES 1. Instancias reales del problema muy largas 2. Errores Inserciones, deleciones, sustituciones Fragmentos quiméricos Contaminación Regiones repetidas 3. Orientación desconocida 4. Regiones repetidas 5. Pérdida de cobertura

12 12 Inserción: inserta una base o varias (fragmento). Deleción: se pierde una base o varias (fragmento). Sustitución: cambio de una base por otra. Contaminación con vector: existencia de vector entre los fragmentos de ADN a secuenciar. Fragmento quimérico: unión de dos fragmentos de ADN que no son parte contigua en el ADN target. Orientación desconocida: se desconoce a que hebra pertenece cada fragmento (aunque sabemos que la lectura es de 5’ a 3’. (Problema vs. Beneficio)

13 13 Regiones repetidas: sucesiones de nucleótidos que aparecen más de una vez. Falta de cubrimiento: quedan gaps, en la secuencia, se define cubrimiento en la posición i del target como el número de fragmentos que cubren esta posición. (concepto imposible de computar, no se conocen las posiciones de los fragmentos en el target. Se saca el cubrimiento medio)

14 14 ERRORES 1-5 errores / 100 caracteres FRAGMENTOS TARGET ACCGT --ACCGT-- CGTGC ----CGTGC TTAC TTAC----- TGCCGT -TGCCGT-- TTACCGTGC Error de sustitución en la segunda posición del último fragmento donde la A fue remplazada por una G

15 15 FRAGMENTO TARGET ACCGT --ACC-GT-- CAGTGC ----CAGTGC TTAC TTAC------ TACCGT -TACC–GT-- TTACC–GTGC Error de inserción en la segunda posición del segundo fragmento

16 16 FRAGMENTO TARGET ACCGT --ACCGT-- CGTGC ----CGTGC TTAC TTAC----- TACGT -TAC-GT-- TTACCGTGC Deleción en la tercera o cuarta posición del último fragmento

17 17 CACGTCACGT-------- ACGT-ACGT-------- ACTACG--CGTAGT----- GTACT-----AGTAC--- ACTGA--------ACTGA CTGA---------CTGA ORIENTACION DESCONOCIDA

18 18 ACCGT--ACCGT-- CGTGC----CGTGC TTACTTAC----- TACCGT-TACCGT-- TTATGC TTA---TGC FRAGMENTOS QUIMERICOS TTACCGTGC

19 19 REGIONES REPETIDAS x 1 x 2 Los bloques marcados con x 1 y x 2 son aproximadamente la misma secuencia A X B X C X D

20 20 A X C X B X D La secuencia ensamblada es ambigua debido a que las repeticiones son de la forma XXX

21 21 Area descubierta Fragmentos ADN FALTA DE CUBRIMIENTO

22 22

23 23 1.Shortest Common Superstring (SCS) 2.Reconstruction 3.Multicontig MODELOS Todos los modelos asumen que la colección de fragmentos esta libre de contaminación y fragmentos quiméricos.

24 24 Shortest Common Superstring (SCS) Características No contempla errores La orientación de cada fragmento debe ser conocida No soporta regiones repetidas Solamente tiene interes teórico, ya que no se lo usa como solución del problema biológico real. Es un problema NP-hard.

25 25 X X La secuencia tiene dos copias de la misma subsecuencia, además estas copias son largas y contienen muchos fragmentos de los cuales conocemos su correcta orientación y no tienen errores.

26 26 X X’ Sin embargo, al intentar buscar el superstring más corto, encontraremos una “mejor solución” si ensablamos todos los fragmentos de la segunda ocurrencia como subcadenas de la primera.

27 27 ALGORITMO Entrada: un conjunto de fragmentos F Salida: S la cadena más corta, donde para todo f que pertenece a F, S es una supercadena de f. (O sea para todo f que pertenece a F, f es una subcadena de S que representará la secuencia de ADN reconstruida)

28 28 Podemos representarlo en un grafo Overlap multigraph (Multigrafo de solapamiento) OM(F) b ACCC TACGA CTAAAG GACA 1 1 1 12 d c a

29 29 Cada eje entre un par de nodos (a, b) tendrá asociado un peso mayor o igual a 0, si el sufijo con t caracteres es prefijo de b. Los pesos en el grafo están representando solapamientos entre fragmentos, utilizaremos estos para unir los fragmentos y formar la supercadena. Dado un camino P en OM(F) podemos construir, un alineamiento múltiple con las secuencias que están en P. Luego la secuencia final puede ser derivada de ese alineamiento, produciendo la supercadena de la siguiente manera:

30 30 Cada eje (a, b) en el camino tiene un peso t, entonces para alinear los fragmentos a y b, b comenzará t posiciones antes del final de a. Ya que el largo de la secuencia generada en el recorrido es igual a la suma de las longitudes de los fragmentos de los nodos menos la suma de los pesos de los ejes usados. Buscamos, el camino hamiltoniano más pesado (camino que usa todos los nodos sin repetir ninguno). Es problema es el Traveling salesman problem, que es NP-Completo.

31 31 camino abcd, peso = 3 TACGA----------- ----ACCC-------- -------CTAAAG--- ------------GACA TACGACCCTAAAGACA camino adbc, peso = 4 TACGA---------- ---GACA-------- ------ACCC----- ---------CTAAAG TACGACACCCTAAAG

32 32 Si resolvemos este problema por fuerza bruta, es decir probando todos los caminos posibles, continuaremos con un algoritmo exponencial. Por eso, debemos intentar otra alternativa. Definición: Algoritmo goloso (greedy): En cada paso intenta maximizar la solución del subproblema analizado. No retrocede una vez tomada cada decisión.

33 33 Contruimos el grafo OG(F) a partir del multigrafo OM(F), dejando entre cada cada par de nodos únicamente el eje más pesado, ya que estamos buscando el camino de peso máximo. El algoritmo comienza ordenando los ejes según el peso, de mayor a menor. En cada paso agrega el proximo eje más pesado, mientras no forme ciclos, y los nodos en los que es incidente, se hayan usado a los sumo una vez, respetando las orientaciones. La solución encontrada es a los sumo 2,75 veces peor que la optima, y se conjetura que lo es 2 veces.

34 34 GCC ATGC TGCAT c b a Este algoritmo, no siempre encuentra la solución óptima. 2 2 3 0 0 0

35 35 RECONSTRUTION Características Contempla errores Contempla la orientación desconocida. No soporta regiones repetidas ni falta de cubrimiento Es un problema NP-hard.

36 36 RECONSTRUTION - Definiciones Veamos al ensamblado como un problema de alineamientos múltiples. Distancia de edición ( d(a,b) ): Función de puntuación de alineamiento entre dos cadenas que otorga un punto por cada inserción, deleción o sustitución. Distancia de edición de subcadena (d s (a,b) ): Es similar a la distancia de edición, pero no agrega puntos por las deleciones en los extremos del segundo segmento.

37 37 RECONSTRUTION - Definiciones Formalmente d s (a,b) = min s en S(b) d(a, s), donde S(b) es el conjunto de todos las subcadenas de b. Error de tolerancia(  ): Entre 0 y 1. f es un subcadena aproximada de S con error  si d s (a,b) <=  |f | donde |f | es la longitud de f.

38 38 ALGORITMO Entrada: Una colección F de fragmentos y un error de tolerancia  entre 0 y 1. Salida: La cadena más corta posible S tal que para cada f en F vale que: min(d s (f,S), d s (f c,S)) <=  |f | donde f c es el complemento de f.

39 39 MULTICONTIG – Definiciones t-contig: Es un contig donde el solapamiento mínimo es de t bases. Se tiene en cuenta cada fragmento o su complemento, pero no ambos. Si es posible construir un t-contig con un colección de fragmentos F diremos que F admite un t-config. Dado un error de tolerancia  diremos que una secuencia S es un consenso-  para un contig, si la distancia de edición entre cada fragmento f en el contig y su imagen en S es a lo sumo  | f |

40 40 ALGORITMO Entrada: Una colección F de fragmentos, un entero t >= 0 y un error de tolerancia  entre 0 y 1. Salida: Una partición de F en la mínima cantidad de subcolecciones C i tal que cada C i admite un t-contig con un consenso-  Es un problema NP-Hard

41 41 EN LA PRACTICA 1.Buscar solapamientos Para cada par de fragmentos, calcular el match prefijo- sufijo Alineamiento semiglobal sin penalidad para Espacios en el final del primer fragmento o el principio del segundo 2.Ordenar de los fragmentos Construir el camino con algoritmos greedy o heurísticas Cada camino tiene su correspondiente camnino complementario No es necesario incluir fragmetnos incluídos en otros Los ciclos y la cubrimiento abundante pueden indicar repeticiones. 3.Alineamiento y consenso

42 42 EN LA PRACTICA TIGR-Assembler CAP2 GAP Dhrap (Univ of Washington, Seattle) En 1994, en el paper A quantitative comparision of DNA sequence assmbly programs, Miller y Powell comparando 11 paquetes distintos encontraron que los resultados fueron muy diferentes.