Chapter 4 Biophysical Concepts S E C T I O N II Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved. Illustrations by Graham Johnson Cell Biology,

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1 Chapter 4 Biophysical Concepts S E C T I O N II Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved. Illustrations by Graham Johnson Cell Biology, 2e Thomas D. Pollard William C. Earnshaw with Jennifer Lippincott-Schwartz José A. Cardé- Serrano, PhD Biol 4018 – Celular-Molecular UPR-Aguadilla

2 Objetivos Definir terminología básica de termodinámica y biofísica. Reconocer el orden de las reacciones biológicas Describir las leyes de termodinámica y sus aplicaciones a las interacciones moleculares. Describir los enlaces químicos responsables de las estructuras orgánicas en las células.

3 Terminolgía: Constante de velocidad (k) = relaciona la concentración de los reactivos ([A] y [B]) a la velocidad o razón de la reacción Velocidad de la reacción = mide con que velocidad cambian las concentraciones de los reactivos [R] y de los productos [P]. Constante de equilibrio (K) = es la razón o proporción entre la concentración de reactivos y la de productos en equilibrio. [R]/[P] –Esta relacionada directamente: a las constantes de velocidad (kR y kP) para ambas reacciones ( ,  ), y a las concentraciones de reactivos y productos en equilibrio.

4 First order reactions: one reactant ( R  P ) Rate = k [A], where k is the rate constant, units = s -1 Rate = k (AB) k k Fig. 4-1 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

5 Reacciones de Primer Orden La velocidad (rate) de estas reacciones es α a la concentración de reactivos Se calcula: Rate = k [R] = M s -1 –Según se usan los reactivos (y baja su [ ]), la velocidad decae proporcionalmente k = probabilidad por unidad de tiempo. Resúmen: La razón (velocidad) de la reacción de primer orden es igual al producto de la constante, k, (que es característica de la reacción) y la concentración del reactivo

6 Second order reactions: two reactants – R1 + R2  P Rate = k [A][B[, where k is the rate constant, units = M -1 s -1 The value of k (a) depends on the sum of the diffusion coefficients of A and B; (b) is proportional to interaction area; (c) is about 1-10 µM -1 s -1 for proteins k k k Fig. 4-2 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

7 Reacciones de Segundo Orden k+ es determinado por la razón o velocidad de colisión de las moléculas. La velocidad dependerá a su vez de la razón de difusión de cada molécula, que dependerá de: –Tamaño y Forma –Temperatura –Orientación -Viscosidad del medio -D= Coeficiente de difusión

8 Reacciones de Segundo Orden - Resumen La razón de la reacción de segundo orden es el producto de la constante (k) (que es característica de la reacción) y la concentración de los reactivos (R1 y R2) Rate =k [R1] [R2] –En reacciones de asociación bimoleculares, la velocidad es determinada por las velocidades de colisión y a su vez limitada por la velocidad de difusión

9 Reacciones reversibles La razón de la reacción es igual a la diferencia entre las razones de las reacciones forward (  ) y reverse (  ). Combinación de Rxns de primer y segundo orden. Ejs: –Cambios conformacionales –Reacciones bimoleculares de asociación y disociación

10 Reversible conformational change At equilibrium the rates in the two directions are equal k + [A] = k - [A*] The equilibrium constant, rate when the net concentrations of A and A*, NO longer change, K eq = k + /k - = [A*]/[A] k+k+ k-k- Fig. 4-1 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

11 Net rate =k + [A][B] – k - [AB] At equilibrium the rates are the same in both directions, so k + [A][B] = k - [AB] The association equilibrium constant, K a = k + /k - = [AB]/[A][B] The dissociation equilibrium constant, K d = k - /k + = [A][B]/[AB] k+k+ k-k- Reversible binding reaction Rate of association= k+ [A][B]; Rate of dissociation= k- [AB] Fig. 4-1 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

12 Termodinámica La fuerza motora de las rxns químicas es la disminución de la energía libre en el sistema. Potencial químico de X sustancia; μ = μ 0 + RT ln C. En condiciones “standard”; C = 1 y PLT μ = μ 0 Condiciones “standard”; donde 1 mol de R es convertido a 1 mol de P; ΔG 0 = μ 0P – μ 0R ; en condiciones estandar

13 Termodinámica ΔG 0 = μ 0P – μ 0R ; en condiciones estándar La mayoría de las rxns no ocurren en condiciones estandar asi que deben ser ajustadas para la concentración, incluyendo en ellas el término (RT ln C) ΔG o = µ oP + RT ln [P] - µ oR – RT ln [R] ΔG = ΔG 0 + RT ln [P] / [R] (tomar en consideración las [ ]s) En equilibrio; cuando ΔG=0; -ΔG 0 = RT ln [P eq ] / [R eq ] -ΔG 0 = RT ln K K = e -ΔGº/RT = [P eq ] / [R eq ]

14 K = e -ΔGº/RT =K + /K - = [P eq ] / [R eq ] Si el ΔGº = 0, K=1, porque [P] = [R] Si el ΔGº 1, porque [P] ? [R] Si el ΔGº > 0, K<1, porque [P] ? [R] ΔG =ΔH - TΔS ΔH = cambio en entalpía. Medida del cambio en energía de los enlaces en las moléculas entre productos y reactivos (liberado o almacenado) ΔS = cambio en entropía. Medida del cambio en el orden de los productos y reactivos. Un aumento en la entropía provee el ΔG necesario para las rxn biológicas. Reacciones son favorecidas si este (ΔS) es +, o sea los productos son menos ordenados que los reactivos y si el ΔG es como?

15 2da ley de Termodinámica: Entropía

16 Que determina el que una reacción ocurra? Cambio en E libre ΔG E reactivos > E prod PLT disminuye E libre  G negativo E reactivos < E prod PLT aumenta E libre  G positivo Es necesario acoplar reacciones

17 “Linked Reactions” (Reacciones acopladas) Muchos de los procesos en la célula envuelven la mezcla de Rnxs. Ejemplo: A + B AB AB AB* El Δ G total para todas las Rxns acopladas tiene que ser negativo.

18 Reversible binding reaction coupled to a conformational change Fig. 4-3 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

19 Reacciones acopladas - Una reacción con  G negativo acoplada a una de  G positivo permitirá que esta última que aumenta el orden, ocurra.

20 Covalent bonds in macromolecules Fig. 4-4 The amino acid cysteine Hydrogen bond Covalent bonds Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

21 Non-covalent bonds important for macromolecular structure ∆G = ∆H - T∆S Fig. 4-5 increases ∆S Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

22 Enlaces químicos Enlaces covalentes =responsables de las estructuras estables de las moléculas orgánicas en la célula. C-C, C-H El sistema utiliza enzimas para catalizar la formación o disociación de estos enlaces.

23 Enlaces químicos Enlaces de hidrógeno –Ocurren entre un átomo donador (O o N) de un H y un átomo aceptador (O o N). –Estabilizan estructuras secundarias de proteínas Enlaces electroestático –COO - y NH 3 + –Neutralizado por grupos inorgánicos –Estructuras no específicas.

24 Enlace hidrofóbico –Aumento del ΔS. Perdida del orden del agua que rodea la macromolécula El agua no forma enlaces de hidrógenos con los lípidos y proteínas. –No confiere especificidad en la interación intermolecular Enlaces químicos

25 Interacciones de van der Waals –Interacción entre los electrones de átomos cercanos. –Dependientes de la distancia –Significante cuando muchas interacciones se combinan. –Evitan interacciones no específicas.

26 Ras GTPase Asignado Crystal structures of inactive (GDP) & active (GTP) conformations Enzyme mechanism determined by transient kinetic analysis G: Ras GTPase T: GTP D: GDP P: phosphate GAP: GTPase activating protein GEF: GDP exchange factor GDI: GDP dissociation inhibitor Fig. 4-6 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

27 Dissection of the Ras enzyme mechanism Asignado Transient kinetic experiments Time course of each reaction gives one of the rate constants Fig. 4-7 Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

28 Simple enzyme reaction E = enzyme S = substrate P = product E + S  ES  EP  E + P Copyright 2008 by Saunders/Elsevier. All rights reserved.

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31 Inhibidores Inhibitors are compounds which interact with an enzyme to slow down its rate of reaction Many toxic compounds are enzyme inhibitors, being toxic because they inhibit enzymes responsible for vital reactions. Inhibitors can interact with an enzyme in different ways and enzyme kinetics is a major tool in distinguishing between these mechanisms.

32 Inhibicion Competitiva In the presence of a competitive inhibitor the enzyme can bind to the substrate: to form an enzyme-substrate complex, or the inhibitor: to form an enzyme-inhibitor complex.

33 Inhibicion Competitiva Competitive inhibitors prevent the substrate from binding to the enzyme and thereby prevent the enzyme from converting it to product. They are mutually exclusive with the substrate so prior binding of the substrate prevents the inhibitor from binding. Consequently competitive inhibitors are inactive at very high substrate concentrations and do not therefore alter the maximal velocity. They are active at low substrate concentrations which is seen as an increase in the slope of the Lineweaver-Burk plot. They reduce the affinity of the enzyme for its substrate; seen as an increase in the Michaelis constant.

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35 Inhibicion Competitiva Effects on Km Km is an indication of enzyme- substrate affinity. Km In the presence of a competitive inhibitor some enzyme molecules will exist as free enzymes, others as enzyme- inhibitor complexes. So a competitive inhibitor reduces enzyme-substrate affinity, or increases Km. Effects on Vmax Vmax is the velocity at very high substrate concentration. Vmax Under these conditions the inhibitor is competed out by the substrate and does not inhibit the enzyme at all. So competitive inhibitors do not slow the reaction at high substrate concentrations and then is no change in Vmax.

36 Inhibicion NO-Competitiva A noncompetitive inhibitor binds to an inhibitor site on the enzyme which is remote from the active site and brings about a conformational change in the active site. In this sense it's very similar to one of the competitive inhibitor types. The difference is that this time the change in the active site is such that it does not prevent substrate binding but, rather, prevents the enzyme from converting the bound substrate to product.

37 Inhibicion NO-Competitiva Effects on Km A classical noncompetitive inhibitor has no effect whatsoever on substrate binding so the enzyme-substrate affinity, and hence the Km, are unchanged. Effects on Vmax Noncompetitive, of both the classical and mixed varieties, inhibit at high substrate concentrations so the Vmax is decreased.

38 Inhibicion

39 Modelo Michaelis-Menten

40 Lineweaver Burke