- MICROSCOPIA Y TECNICAS DE ESTUDIO CELULAR –

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1 - MICROSCOPIA Y TECNICAS DE ESTUDIO CELULAR –
INTRODUCCION A LA BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR - MICROSCOPIA Y TECNICAS DE ESTUDIO CELULAR –

2 equipo en esas condiciones Distancia mínima a la cual
Características de un Microscopio Magnificación Resolución Aumento que logra el equipo en esas condiciones Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos separados

3 Microscopio: Componentes
Lentes oculares Ajuste macrométrico micrométrico Objetivos Condensador Platina Fuente de luz Control de voltaje

4 Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar
Microscopio: Objetivos y concepto de Resolución Resolución Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos separados R = l 2n(sen m) Tres características críticas en el diseño de los objetivos determina el límite de resolución en un microscopio: 1- longitud de onda (l): aquella usada para iluminar la muestra 2- apertura angular (m): del cono de luz capturado por el objetivo 3- índice de refracción (n): del medio que se encuentra entre el objetivo y la muestra.

5 Resolución: Apertura numérica (NA)
Apertura numérica (NA): medida de la habilidad del objetivo de colectar luz y de resolver detalles finos de la muestra a una distancia fijada. Y esta determinada por: Apertura angular(m): las ondas generadas cuando la luz atraviesa la muestra entran en el objetivo en un cono invertido, el corte longitudinal de este cono determinan este parámetro. Que a su vez esta determinado por la longitud focal del objetivo Indice de refracción (n): del medio que se encuentra entre el frente de la lente y el cubre objeto. NA = n sen (m)

6 Resolución: Indice de refracción (n)
(a) Interfase de aire: Los rayos que atraviesan la muestra son refractados y solamente los dos rayos mas cercanos al eje óptico tiene el ángulo apropiado para entrar por la lente del objetivo. (b) Interfase de aceite: en este caso el aire se reemplaza colocando aceite de inmersión cuyo índice de refracción es el mismo que el del vidrio y los rayos pasan a través de esta interfase son ninguna desviación debido a la refracción

7 Resolución: Longitud de onda ()
El espectro de luz blanca esta constituido por distintas longitudes de onda, aquellas que poseen menor longitud son aquellas que se dispersan mas o sea que varían mas su ángulo luego de incidir sobre la muestra.

8 Microscopio: Formación de la imagen y el efecto de la interferencia
Alguno de estos rayos desviados se encuentran 180º desfasados con respecto a los rayos que no han sido modificados, causando una interferencia destructiva y que conlleva a una reducción en la intensidad y genera áreas más o menos oscuras. Este patrón de luces y sombras son las que finalmente generan la imagen de la muestra.

9 Microscopio: El problema del contraste
El contraste producido por una muestra es una medida de distintos fenómenos entre ellos: * la luz absorbida * brillo * refractancia * difracción * fluorescencia * rayos desviados * o variaciones en el color Entonces la capacidad de un detalle de sobresalir por sobre el background es una medida de su contraste: porcentaje de contraste (C) = (Is –Ib) x donde Is: intensidad de la muestra Ib Ib: intensidad del background

10 Microscopio de campo oscuro:
El microscopio de campo oscuro es una técnica de iluminación especializada que capitaliza un direccionamiento oblicuo de la misma para aumentar el contraste. En el condensador se coloca un stop opaco de tal manera que los rayos lumínicos que pasan a través de la muestra a partir del ángulo oblicuo son difractados, refractados y reflejados hacia el objetivo generando una imagen brillante sobre un fondo oscuro.

11 Microscopio de contraste de fase:
Objetos en fase son aquellos que son incapaces de absorber luz, alterando levemente la fase de la luz en ¼ de onda con respecto a la luz de orden 0 y esto es imperceptible para el ojo. Esta técnica emplea un mecanismo óptico que traslada estas pequeñas diferencias en la fase de una onda en su correspondiente cambio en la amplitud, pudiéndose visualizar como diferencias en el contraste de la imagen.

12 Microscopio de contraste de interferencia diferencial (DIC) o Nomarsky
Básicamente es un microscopio de luz polarizada al que se le adicionan 2 prismas, uno por debajo del condensador y el otro por detrás del objetivo. Aumentando la resolución y evitando la generación de artefactos.

13 Microscopio de Fluorescencia: Conceptos básicos de fluorescencia

14 Inmunofluorescencia Fluoresceina Ficoeritrina Rodamina Naranja
de Acridina DAPI Bromuro de Etidio

15 Microscopio Confocal: No irse de plano….

16 Microscopios electrónicos de Barrido y Transmisión
ME de transmisión ME de barrido Fuente de electrones Permiten una capacidad de aumento de hasta x en comparación de los microscopios ópticos que solo consiguen una magnificación de 1000x, dado que el l de los electrones es mucho menor que la de fotones.

17 Microscopía electrónica. Ventajas y desventajas
proporciona resultados de amplia resolución y magnificación que permiten visualizar muestras muy pequeñas. Desventajas • elevados costos de los equipos  y una infraestructura adecuada y esto impide el uso de esta técnica en cualquier laboratorio. • altos costos de procesamiento de las muestras la manipulación de reactivos se  torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos. procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos • la complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado.

18 Comparación entre imágenes de distintos microscopios
Microscopio electrónico de barrido Microscopio electrónico de transmisión

19 Otras técnicas…….Fluorescent IN SITU Hibridization (FISH)
Es una técnica relativamente nueva donde se usan sondas de ADN marcadas fluorescentemente para detectar o confirmar anormalidades cromosómicas o génicas, las muestras de ADN (ya sea núcleos interfásicos o los cromosomas metafásicos) son desnaturalizadas para separar ambas cadenas, se agrega luego la sonda de interés y se procede a la hibridización. La señal de la sonda puede ser detectada mediante microscopía de fluorescencia.

20 Citometría de Flujo Las células pueden estar vivas o fijadas pero deben estar dispersas, ya que deben pasar en fila india a través del rayo láser en un flujo continuo de la suspensión. Cada célula dispersa parte de la luz del láser y a su vez emite fluorescencia si estas células han sido marcadas. La luz emitida es captada por los fotomultiplicadores (PMT) que captan una determinada longitud de. onda y amplifican su señal. Esto me permite evaluar distintos parámetros a la vez: 1- dispersión lateral debido al diametro celular 2- dispersión ortogonal proporcional a la estructura granular de la célula 3- fluorescencia por marcaje con fluorocromos.

21 Citometría de flujo y cell sorting

22 Protocolos Técnicas histológicas: Sirven en conjunto para facilitar el estudio de las muestras de tejidos. Espesor de la muestra Técnicas de fijación: permite que el tejido a analizar no pierda su conformación durante la manipulación y cuando es sometido al corte. Permitiendo mantener la morfología y la composición química de la célula con la menor cantidad de artefactos. Además cuanto mayor sea la firmeza de la muestra se podrán realizar cortes más delgados. Medios físicos: en general se utiliza calor o frío extremo (-160 a -190ºC) seguida de deshidratación al vacío a -30/-40ºC Medios químicos: por ejemplo: formol, formaldehído, glutaraldehído, metanol o ácido acético dependiendo del tipo de macromolécula que se quiera analizar. En general estos compuestos llevan a la deshidratación del tejido y llevan la formación de fuertes uniones entre las moléculas. Desventajas: en general se generan artefactos producto de la deshidratación de la muestra en el caso del tratamiento en frío se compensa esto.

23 Espesor de la muestra: AUMENTANDO LA FIRMEZA….
1- Congelación 2- Inclusión en parafina: si bien este tratamiento aumenta la consistencia del tejido y permite obtener secciones de menor espesor (1-50 mm) y mayor calidad. Es una sustancia hidrofóbica por lo que primero el tejido debe ser deshidratado. ¿Cómo se realizan los cortes? Micrótomos: son instrumentos que permiten la obtención de estos cortes ultrafinos hay de distinto tipo; por ejemplo de congelamiento o ultramicrótomo

24 Contraste de la muestra y los problemas asociados
Las características de las muestran hacen que tengan un índice de refracción similar a la luz de orden 0 por lo tanto la muestran se suelen colorear o teñir. En general estos colorantes son compuestos orgánicos y aromáticos; son capaces de explotar las propiedades que poseen algunos componentes celulares de ionizarse como bases o ácidos. Colorantes ácidos: tienen la capacidad de unirse a moléculas que presentan carga + , algunos ejemplos son: ácido pícrico, eosina, naranja G y azul de anilina. Colorantes básicos: tienen la capacidad de unirse a moléculas que presentan carga -, algunos ejemplos son: azul de metileno, hematoxilina, cristal violeta, safranina. Dado que la mayoría de los colorantes son solubles en agua las muestras deben re-hidratarse antes de su tinción

25 Microscopía: Un poquito de óptica
Difracción En física, la difracción es un fenómeno característico de las ondas que consiste en la dispersión y curvado aparente de las ondas cuando encuentran un obstáculo. Reflexión y Refracción La reflexión es el cambio abrupto en la dirección de la onda cuando ésta llega a la unión de dos medios diferentes, regresando al medio original. Por otro lado, la refracción es el cambio en velocidad de una onda cuando pasa de un medio a otro. A menudo el cambio en velocidad implica un cambio de dirección. Dispersión de la luz El grado con el que una onda se refracta al cambiar de medio depende de las características propias de la onda. En el caso de la luz, no se refracta igual la luz azul que la luz roja. Así, cuando varias ondas viajan juntas y cambian de medio, las distintas ondas que la forman pueden separarse, un ejemplo es un prisma.

26 ¿Cómo funcionan las lentes de un microscopio?
La luz de un objeto muy lejano a la lente entran en foco en un punto por detrás de la lente = punto focal localizado en el plano focal. La imagen virtual que se obtiene es menor que la del objeto real. Si ahora acercamos el objeto, vemos que si bien la distancia focal no varia mientras que la imagen virtual aumenta. 2x df Si acercamos nuestro objeto hasta alcanzar una distancia que es 2 veces la distancia focal obtenemos una imagen virtual del mismo tamaño que el objeto real pero invertido Finalmente si el objeto es colocado justo por delante de la lente el objeto virtual es de mayor tamaño que el real, obteniéndose una MAGNIFICACION del objeto.