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Organización genética y regulación
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Regulación + Ausencia de sustrato Presencia de sustrato ARN-Polimerasa
ADN Gen Ausencia de sustrato Regulador ADN Gen Presencia de sustrato ARN-Polimerasa Regulador + ARN Proteínas
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Genes Reguladores ARN-Polimerasa Gen ADN ARN Ribosomas Proteínas
Operón Proteínas
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pWW0 Tra/Rep C L H J K B R F M A T J C O tnpA I (Tn4653 ) G N S X tnpT
tnpS G 117 kb B H res E xylR H tnpA I Operón xylS (Tn4561 ) F upper V Operón D F meta Q G E D D J XhoI A C E EcoRI P HindIII A Tn4653 Tn4651
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• Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca)
pWW0 P. putida mt-2 • Clonación de la ruta a partir del plásmido TOL aislado (genoteca) • Mutagénesis al azar • Mapeo y localización de los mutantes (secuenciación) • Análisis bioquímico: identificación de gen-función U W C M A B N xyl Operón upper X Y Z L T E F G J Q K H I S R Operón meta Organización genética
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Regulación de la expresión
Determinar actividades en células creciendo en distintos medios: No-sustrato de la ruta (acetato) Sustratos de la ruta upper Sustratos de la ruta meta Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD Acetato Tolueno Bencilalcohol Benzoato 3-metilbenzoato Acetato + Tolueno
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TODAS las actividades son inducibles
Sustratos de la ruta meta sólo inducen a la ruta meta Sustratos de la ruta upper inducen tanto a la ruta upper como a la ruta meta Mutante PaW210: Sustrato de crecimiento TO BADH C2,3DO HMSD Acetato Tolueno Bencilalcohol Benzoato 3-metilbenzoato Ruta upper NO es inducible Ruta meta SÓLO es inducible por sustratos de meta
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? Esquema de regulación XylS XylR + + benzoatos xylS xylR
xylXYLTEGFJQKIH xylUWCMABN Pu Pm upper meta tolueno + Reguladores XylR ?
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Examinar regulación en AUSENCIA de las rutas
Fusiones transcripcionales Huésped heterólogo (Escherichia coli) Promotor Gen marcador desprovisto de promotor propio xylS xylR Pm:: ‘lacZ E. coli E. coli (pKT570, pJLR107) Inductor Actividad -galactosidasa Ninguno 3-metilbenzoato Xyleno • Xyleno NO tiene que ser metabolizado para activar la ruta meta
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Expresión de XylS en P. putida mt-2
Altas concentraciones de XylS en la células activan la ruta meta en ausencia de inductor Expresión de XylS en P. putida mt-2 P. putida (pWW0) Inductor niveles de mRNA de xylS Ninguno 3-metilbenzoato Xyleno xileno xylS 3-metilbenxzoato ninguno Xyleno (XylR) activa la síntesis de XylS
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XylS XylR + Pr1 Pr2 xylR Ps1 xylS xylXYLTEGFJQKIH
xylUWCMABN Pu tolueno benzoatos Ps2 Pm upper meta Reguladores XylR XylS
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XylS XylR 32/38 - + 54 70 IHF Pr1 Pr2 xylR
xylXYLTEGFJQKIH xylUWCMABN Pu - tolueno 54 IHF Ps2 benzoatos Pm upper meta Reguladores 70 XylS XylR Ps1 xylS BenR
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Reguladores XylR C • Activa a los promotores Pu y Ps
• Es dependiente de 54 (familia NtrC) • Reprime su propia expresión • IHF activa en Pu y reprime en Ps • En Ps HU es necesaria • Requiere activación por un efector • Represión dependiente de la presencia de otras fuentes de C
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Perfil de efectores A B C D Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 2NT
CH2OH CH3 CH3 NO2 Mutagénesis química Regulador - 3-MBA 2NT 3-NT XylR 180 XylR6 1150 XylR49 1500 XylR7 150 XylR49-7 70 1050 1900 2600 900 1000 2900 3550 950 90 450 3000 A B C D 85 Pro Ser 135 Asp Asn 172 Glu Lys
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C C C Activación de un regulador A Regulador XylR Reprimido Deleción A
ADP + Pi ADP + Pi C ATP ATP Activado por el efector (desreprimido) Constitutivo O‘Neill & al., 1998
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Represión catabólica Sistema PTS CRC? Otro? Cultivo contínuo
Tasa de dilución (h-1) Expresión de la ruta upper Cultivo contínuo (limitación de C) 0.05 0. 5 0.75 Crecimiento Expresión de la ruta upper Inductor Medio rico Limitación Expresión de la ruta upper Cultivo contínuo (0.05 h-1) C O2 N P S Sistema PTS CRC? Otro?
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Elementos que participan en la regulación
54-polimerasa xylS xylR XylR IHF 70-polimerasa Elementos que participan en la regulación XylR Activa Reprime IHF Facilita Impide Efector ¿ Represor?
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Expresión de la ruta meta
Reguladores Crecimiento Expresión de la ruta meta Inductor 32 38 XylS • Activa al promotor Pm • Pertenece a la familia AraC • Es dependiente de 32 y 38 • Requiere activación por un efector Extremo N-terminal C-terminal a1 a2 a3 a4 a7 a6 a5
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XylS X Pm :: ‘lacZ - 39 2FBz 343 Bz 6369 3FBz 6801 2MBz 2724 4FBz 2886
Efector Actividad Efector Actividad FBz Bz FBz 6801 2MBz FBz 2886 3MBz ClBz 4MBz ClBz 9034 2,3DMBz ClBz 2991 2,4DMBz ,6DClBz 397 2,5DMBz ,5DClBz 381 2,6DMBz BrBz 3,4DMBz BrBz 5372 3,5DMBz BrBz 1726 X
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XylS Pm :: tet • Mutagénesis química de XylS (NTG)
• Selección de resitencia a Tetraciclina: - Constitutiva. - Inducible por distintos efectores. • Identificación del residuo mutado Extremo N-terminal C-terminal Motivo HTH-1 Motivo HTH-2 a1 a2 a3 a4 a7 a6 a5 Unión del efector
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XylS/Pm:lacZ wt 8000 -galactosidase (Miller U) 4000 rpoS rpoH
2 4 6 8 Time (h)
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- 32 + DnaKJ Respuesta HS Proteínas desnaturalizadas estress
NO estress - Promotores dependientes de 32 32 +
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32 + DnaKJ Respuesta HS Proteínas desnaturalizadas estress
Promotores dependientes de 32 32 +
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3-metilbenzoato -Galactosidase (Miller U)
Respuesta a choque térmico 3-metilbenzoato -Galactosidase (Miller U) PrpoDhs-lacZ
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38 + 32 - 54 70 HS XylS Pm FtsH XylR Pu (XylR) IHF Fase
estacionaria 32 38 XylS XylR (XylR) Pm + Pu COOH benzoato CH3 tolueno HS 70 FtsH 54 IHF Limitación anabólica -
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Incidencia sobre otras poblaciones
Consecuencias • Represión catabólica: MEZCLAS • Activación del regulador: INDUCIBILIDAD La inacapacidad de una cepa para degradar un determinado compuesto aromático puede tener dos causas: - Enzima(s) no reconocen el sustrato - El regulador no reconocen al inductor, no se activa la ruta • Plásmido % células TOL+ 100 50 tiempo benzoato o-xyl tolueno Transferible Incidencia sobre otras poblaciones Tol tiene además 2 transposones! Inestable Retrotransferencia
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TOL TOD TOM TBU T4MO P. putida mt-2 P. putida F1 B. cepacia G4
R. pickettii PK01 T4MO P. mendocina KR1
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+ + - + - Cromosoma (ruta orto) P. putida mt-2 benABC(DKEF)
PbenA benR PbenR benzoato XylS + catBCA PcatB catR PcatR + - cis,cis-muconato pcaK pcaF pcaTB(DC) pcaR PpcaR b-cetoadipato + - PpcaK PpcaF PpcaT pcaIJ PpcaI
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-P P- + A B C1 X D R* F E I G H C2 tod T S cromosoma tolueno
P. putida F1 TOD A B C1 X D R* F E I G H C2 tod T S cromosoma todXFC1C2BADEGIH todST PtodX PtodS P- -P + tolueno Tolueno dioxigenasa meta Reguladores
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+ 54 tbm A B C D E F plásmido Burkholderia sp. JS150 TOM
Tolueno 2-monooxigenasa plásmido tbmABCDEF PtbmA tb4m tolueno tbmR 54 + Regulador Tolueno/benceno 2-monooxigenasa Tolueno 4-monooxigenasa
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Tolueno 3-monooxigenasa
Ralstonia pickettii PKO1 TBU B tbu A1 U V A2 C T X D R S F E W I K G J H cromosoma Operón meta Tolueno 3-monooxigenasa Fenol hidroxilasa Proteína de membrana tbuR tbuS tbuA1UVBVA2CT PtbuA1 tbuX PtbuX 70? 54 JIKGFEW tbu PtbuW tbuD PtbuD ANR? tolueno + meta Tolueno 3-monooxigenasa regulador Fenol hidroxilasa Proteína de membrana Reguladores
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p-cresol metilhidroxilasa p-hidroxibenzaldehído
P. mendocina KR1 T4MO C tmo A B D E F pcuCAB pobA cromosoma Tolueno 4-monooxigenasa p-cresol metilhidroxilasa + p-hidroxibenzaldehído deshidrogenasa p-hidroxibenzoato hidroxilasa
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D C A B S R tdi bss ? E tut tutB A D B C E G F I H bbs fdx had oah dch
Thauera aromatica K172 D C A B S R tdi bss reguladores bencilsuccinato sintetasa ? E tut tutB A D B C E G F I H bbs fdx had oah dch bcr B A D C benzoilCoA reductasa
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Bencilsuccinato sintetasa
Thauera aromatica K172 -P P- tolueno + PtdiS tdiSR PbssD bssDCAB Reguladores Bencilsuccinato sintetasa
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Características de la regulación
En todos los casos estudiados, las enzimas sólo están presentes cuando las células se cultivan en presencia de tolueno: INDUCIBLES Reguladores del tipo de 2 componentes Sometidos a represión catabólica Anaerobias facultativas Expresión reprimida en presencia de O2 AadR (FNR) Activación en respuesta a anaerobiosis Cuando la cepa puede degradar tanto en aerobiosis como en anaerobiosis, las rutas y su regulación son distintas.
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