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Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal. Introducción. Bases fundamentales para la creación de organismos modificados genéticamente.

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Presentación del tema: "Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal. Introducción. Bases fundamentales para la creación de organismos modificados genéticamente."— Transcripción de la presentación:

1 Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal. Introducción. Bases fundamentales para la creación de organismos modificados genéticamente (OMG). OMG aplicados a la cría y salud animal. Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal. Introducción. Bases fundamentales para la creación de organismos modificados genéticamente (OMG). OMG aplicados a la cría y salud animal. Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal.

2 BIBLIOGRAFÍA LIBROS GENERALES - Griffiths, A.J., Gelbart, W.M., Miller, J.H. y Lewontin, R.C. Genética Moderna, Strachan, T., Read, A.P. Genética Molecular Humana, Klug, W.S. y Cummings, M.R. Conceptos de Genética, INTERNET -Transgénesis en mamíferos -The Jackson Laboratory -Buscador general -Terapia génica. and

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4 Animal transgénico para la Esclerosis Lateral Amiotrófica

5 DE MENDEL A LA CLONACIÓN...

6 Genética de la transmisión Mecanismos de acción génica DNA recombinante Genética inversa Transgénesis y Terapia Génica Chips de ADN Clonación de un mamífero Genoma Humano/Células madres humanas.

7 Pero,¿qué necesitaremos recordar?

8 Estructura de un gen PROMOTOR RNA (cDNA) Intrones Exones PROTEÍNA

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10 ¿ Qué son los organismos modificados genéticamente? Cualquier organismo cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o en la recombinación natural. (Directiva 90/220/CEE)

11 La transgénesis, es decir, el diseño de un genotipo específico mediante la adición de DNA exógeno a un genoma, supone una ampliación de la mejora génética clásica,tanto para la investigación básica como con fines comerciales. (Griffiths y cols, 2002)

12 Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal. Bases fundamentales para la creación de organismos modificados genéticamente (OMG). - Qué vamos a insertar: Azar o recombinación homóloga. - Cómo lo vamos a insertar OMG aplicados a la cría y salud animal. - ¿Dónde? Y ¿Para qué? Bases fundamentales para la creación de organismos modificados genéticamente (OMG). - Qué vamos a insertar: Azar o recombinación homóloga. - Cómo lo vamos a insertar OMG aplicados a la cría y salud animal. - ¿Dónde? Y ¿Para qué?

13 Recombinaciónhomóloga Al azar TRANSGÉNESIS

14 GENOMA GEN TRANSGÉN

15 GEN Al azar TRANSGÉN Concatémeros Gen crucial Zonas metiladas

16 Muertecelular

17 CONSTRUCCIÓN GENÉTICA (Normalmente plásmidos, ahora otros vectores también) Gen de resistencia a antibióticos (normalmente Ampicilina) con promotores procariotas El ADN que queremos insertar Gen de resistencia a antibióticos (normalmente Ampicilina) con promotores procariotas El ADN que queremos insertar ¿TRANSGÉN?

18 Expresión Localización de la expresión Regulación de la expresión. cDNA, DNA genómico. Promotor. Enhancer, elementos cis y trans. ¿De qué constará el ADN que queremos insertar?

19 s1-antitripsina humana s1-antitripsina humana Promotor -lactoglobulina bovina Promotor -lactoglobulina bovina Transgén simple

20 ¿Por qué no lo pones en la pizarra que nos enteraremos más?

21 GEN TRANSGÉN Recombinación homóloga Recombinación homóloga TRANSGÉN

22 Para poder realizar la recombinación homóloga son necesarias células en cultivo

23 Knock-in: Animal creado mediante recombinación homóloga para que un gen se exprese bajo el promotor que deseemos. Knock-out: (fuera de combate) Animal creado mediante recombinación homóloga para evitar la expresión de un gen. Términos utilizados

24 -Zona homólogas al gen de interés. -Resistencia a antibióticos/mismo gen: - Kanamicina (procariotas) - Neomicina (eucariotas) ¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa? Knock-out -Opcional: - Gen marcador - Gen de expresión. Knock-in

25 GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO CONSTRUCCIÓN GENÉTICA CONSTRUCCIÓN GENÉTICA M Genmarcador R Resistencia Recombinación homóloga Promotor p DNA

26 GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO Recombinación homóloga DNADNA MM GenmarcadorGenmarcadorRRResistenciaResistencia Promotor p CONSTRUCCIÓN GENÉTICA CONSTRUCCIÓN GENÉTICA

27 CONSTRUCCIÓN GENÉTICA CONSTRUCCIÓN GENÉTICA GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO Recombinación homóloga DNADNA MM GenmarcadorGenmarcadorRRResistenciaResistencia Promotor p

28 Más pizarra

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31 TRANSGÉNESIS AL AZAR TRANSGÉNESIS POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Directamente en el embrión En cultivos celulares

32 CULTIVOS CELULARES Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el embrión u óvulo

33 MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN

34 DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN. REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN. REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

35 IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES DIRECTOS INDIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

36 IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES DIRECTOS INDIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

37 Esponda, P. C.B.I. y C.S.I.C Esponda, P. C.B.I. y C.S.I.C ESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDES

38 IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES DIRECTOS INDIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

39 Biolística o método de bombardeo.

40 Partículas de tungsteno u oroPartículas de tungsteno u oro Descarga con helio.Descarga con helio. Características: –Capacidad de introducción limitada. HA SIDO MUY UTILIZADA EN PLANTAS Biolística o método de bombardeo.

41 IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES DIRECTOS INDIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

42 Microinyección en el pronúcleo masculino.Microinyección en el pronúcleo masculino. Microinyección en el citoplasma del huevo.Microinyección en el citoplasma del huevo. Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.) MICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓN

43 Transgen Cigotos Introducir el transgén en el cigoto Desarrollar el embrión Construcción al azar. Animales donadores. Micromanipulador. Madres receptoras ¿Qué necesitamos para realizar la microinyección?

44 Ovulación cíclica y corta (ratón, rata). –Machos y hembras donadoras –Hembras receptoras y machos vasectomizados Otras especies –Tratamientos hormales en las hembras. –Hembras donadoras y receptoras y machos. ¿Como consigo los cigotos?

45 Micromanipulador

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48 Pronúcleo masculino

49 En animales domésticos (sobre todo en la especie porcina) es necesario centrifugar el huevo debido al vitelo.

50 IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES INDIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P DIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

51 IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES INDIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P DIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

52 Agrobacterium tumefaciens con gen de interes DNA de la planta Co-cultivo 48 horas 22ºC Formación de callos Aislamiento de posibles plantas transformadas DNA insertado en el genoma Pruebas genéticas que permitan controlar la inserción del gen

53 - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES INDIRECTOS DIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

54 CATIÓNICOSCATIÓNICOS –Su carga positiva reacciona con la negativa del DNA formando un complejo. pH SENSIBLE O ANIÓNICOpH SENSIBLE O ANIÓNICO –Mediante una desestabilización por bajo pH el DNA entra en núcleo del liposoma. LIPOSOMASLIPOSOMAS

55 - Retrovirus - Liposomas - Elementos P - Retrovirus - Liposomas - Elementos P IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES DIRECTOS INDIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

56 La microinyección clásica no funciona.La microinyección clásica no funciona. Dos plásmidos:Dos plásmidos: Contiene el transgén.Contiene el transgén. Contiene el trasposón con las secuencias repetidas que ayuda a la inserción (Elementos P)Contiene el trasposón con las secuencias repetidas que ayuda a la inserción (Elementos P) TRANSGÉNESIS DE DROSOPHILA MEDIADO POR ELEMENTOS P

57 - Retrovirus - Liposomas - Elementos P IN VIVO IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES DIRECTOS INDIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección

58 MÉTODOS IN VITRO (Cultivos celulares) MÉTODOS IN VITRO (Cultivos celulares) Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el embrión u óvulo

59 IN VIVO IN VITRO DIRECTOS INDIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Retrovirus - Liposomas - Elementos P - Retrovirus - Liposomas - Elementos P QUÍMICOS FÍSICOS Precipitación con fosfato de calcio Precipitación con fosfato de calcio

60 Coprecipitación de DNA y calcio (presencia de fosfato).Coprecipitación de DNA y calcio (presencia de fosfato). Introducción por endocitosis.Introducción por endocitosis. Eficiencia de transfección 1% (max. 10%)Eficiencia de transfección 1% (max. 10%)Características: - Pequeña expresión del transgén. - Introducción de varias copias. - No hay toxicidad para las células. FOSFATO DE CALCIO

61 IN VIVO IN VITRO DIRECTOS INDIRECTOS - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Espermatozoides - Biolística - Microinyección - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P QUÍMICOS FÍSICOS Precipitación con fosfato de calcio Precipitación con fosfato de calcio Electroporación

62 ELECTROPORACIÓNELECTROPORACIÓN Introducción del transgén por poros nucleares tras un choque eléctrico. Factores de eficacia: naturaleza, distancia entre electrodos, buffer y CÉLULAS.Características: - Mucha muerte celular - TENDENCIA A INTRODUCCIÓN DE UNA SOLA COPIA. ELECCIÓN.

63 ¿Cómo consigo un animal adulto a partir de células en cultivo?

64 DOS OPCIONES Células indiferenciadas que sean capaces de colonizar un embrión y formar parte de su organismo, incluidos los gametos. 1 Células transformadas en indiferenciadas: CLONACIÓN 2

65 Células ES o indiferenciadas SÓLO AISLADAS EN RATÓN

66 Color negro Color marrón Método de agregación de mórulas-células

67 Color negro Color marrón

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71 Knock-out Knock-in

72 NUMEROSOS INTENTOS PERO Las células ES no se han aislado en otras especies animales (Experiencias realizadas en peces)

73 OTROS CULTIVOS CELULARES: Fibroblastos, Glándula mamaria, etc. Clonación de células somáticas

74 DOLLY

75 G0 : - Baja la transcripción. - Baja la traducción. - Condensación de la cromatina

76 PRODUCCIÓN DE: Millie, Christa, Alexis, Carrel y Dotcom Polejaeva, I.A. y cols. (2000) Nature, 407, Polejaeva, I.A. y cols. (2000) Nature, 407,

77 Recombinación homóloga Células in vitro Clonación

78 IN VIVO IN VITRO Al azar Microinyección Biolística (plantas)

79 RatónConejoPorcinoOvinoBovinoEficacia 60%50%40%40%20% Animales Tiempo(meses) (Montoliu, 1999) MICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓN

80 IN VIVO Al azar Recombinación homóloga Electroporación IN VITRO Células ES y clonación Microinyección Biolística (plantas)

81 Sabemos qué es... Sabemos cómo se hace... APLICACIONES

82 PRIMER RATÓN TRANSGÉNICO Promotor Metalotionina I Gen de la Hormona del Crecimiento PALMITER y cols. (1982) Nature, 16,

83 Medline: transgenic animals publicaciones ( )

84 1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal/Nuevos alimentos - Alimentos transgénicos Cambio cuantitativo Cambio cualitativo - Biotecnología de corral 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

85 1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal/Nuevos alimentos - Alimentos transgénicos Cambio cuantitativo Cambio cualitativo - Biotecnología de corral 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

86 1. Estudios en investigación básica. REINO ANIMAL

87 1. Estudios en investigación básica. Funcionamiento de genes - Muchos estudios realizados. - Más interesante la recombinación homóloga - Animal de elección es el ratón (menor coste en tiempo y en dinero) Ejemplo: Un animal Knock-out para una determinada enzima, que nos permita conocer la función de la misma. Un animal knock-in con marcadores para conocer la expresión durante la gestación.

88 1. Estudios en investigación básica. Estudio de promotores, enhancer o cualquier elemento regulador. - Muchos estudios realizados. - Transgénicos clásicos fusionados a un marcador - Animal de elección es el ratón (menor coste en tiempo y en dinero) Ejemplo: Un transgénico con una zona del promotor de una enzima fusionado a la enzima -galactosidasa

89 1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal/Nuevos alimentos - Alimentos transgénicos Cambio cuantitativo Cambio cualitativo - Biotecnología de corral 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

90 2. Producción Animal/Nuevos alimentos Modificaciones cuantitativas - Muchos intentos realizados. - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación.

91 2. Producción Animal/Nuevos alimentos REINO VEGETAL

92 Ejemplo (ya creado): Un Salmón (Aqua Bounty Farms): - Promotor: AFP (proteína anticongelación) - cDNA: Hormona del crecimiento. LA REVOLUCIÓN AZUL!!!!

93 2. Producción Animal/Nuevos alimentos Modificaciones cualitativas - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. Reino vegetal: la mayoría de los alimentos. Reino animal: Proyectos de creación.

94 2. Producción Animal/Nuevos alimentos Reino vegetal - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. - Tomate Flavr-Savr. - Maíz Bt. - Tolerancia a los herbicidas 54% - Resistencia a insectos (Bt) 37% - Resistencia vírica 14% - Rasgos cualitativos >1%

95 2. Producción Animal/Nuevos alimentos Reino vegetal - Promotor: 35 S virus mosaico de coliflor. - RNA antisentido de la enzima poligalacturonasa (actuá sobre la pectina) - Tomate Flavr-Savr: Primer producto transgénico comercializado en el mundo (Mayo de 1994). Maduración retardada.

96 2. Producción Animal/Nuevos alimentos Reino vegetal Maíz que expresa la toxina del Bacillus thuringiensis se une a los receptores del tubo digestivo del insecto (taladro). - Maíz Bt:Muchisima presion social.

97 ¿Qué es un alimento transgénico? -Productos vegetales: tomate "Flavr Svr, Maiz Bt... - Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin determinadas proteínas, etc. - Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias modificadas genéticamente (cuajo recombinante) - Animales tratados con proteínas recombinantes... - Animales alimentados con alimentos transgénicos

98 2. Producción Animal Biotecnología de corral - Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no existían células indiferenciadas en los animales que nos interesan. - Producción de proteínas de interés en sanidad. Ejemplo (ya creado): Tracy (Roslin Institute - PPL Therapeutics)

99 TRACY s1-antitripsina humana s1-antitripsina humana Promotor -lactoglobulina ovina Promotor -lactoglobulina ovina

100 Primeros ensayos en ratón: 4.3 Kb Promotor WAP de ratón 6.6 Kb de AAT-humano cDNA 12.5 gr./litro Obtienen microlitros de leche Volumen/año gr./año Producción vital 8 litros 400 litros l Kg. 2 kg. 50 kg 1 Kg. 100 kg. toneladas Coneja Oveja Vaca

101 Roslin Institute-PPL Therapeutics (lo que sabemos......) s1-antitripsina s1-antitripsinaFibrinógeno Factor VII y Proteína C Factor XI BSSL (lipasa) Anticuerpos humanizados

102 POLLY: Primer clon transgénico

103 Se obtuvieron 4 clones de fibroblastos embrionarios transfectados con: POLLY MOLLY 2 no producían la proteína -lactoglobulina + Factor XI de coagulación

104 1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal - Incremento de productividad Cuantitativo Cualitativo - Biotecnología de corral 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

105 Organismos modelos

106 C.elegans Organismo modelo para investigación de los mecanismos moleculares de las enfermedades Transgénico para el péptido b amiloide o prenisilina, genes relacionados con Alzheimer. Yatin y cols. Neurobiol Aging May-Jun;20(3):325-30; Witerburg y cols.Nature Jul 20;406(6793):306-9.

107 D. Melanogaster GENES HOX DESARROLLO

108 D. Melanogaster Expresión del gen -sinucleína (normal y mutantes) Modelo de Parkinson. Feany y Bender. Nature 2000 Mar 23;404(6776):394-8 Sobreexpresión de Sim2 (homólogo al humano) Modelo de Sindrome de Down. Ema y cols. Hum Mol Genet 1999 Aug;8(8):

109 Primates ANDI 16/01/2001 lº Primate transgénico Inyección en oocitos con retrovirus. Expresión de la GFP (Green Fluorescent protein). Producción de RNA mensajero.

110 Conejos Transgénico para lipoproteina a (Lpa). Modelo para arterioesclerosis. Rouy y cols, J Biol Chem 1998 Jan 9;273(2): Transgénico para lipoproteina a (Lpa). Modelo para arterioesclerosis. Rouy y cols, J Biol Chem 1998 Jan 9;273(2):1247-5

111 Ratón Especie de elección Metodología de creación puesta a punto. Corto intervalo generacional Numerosos descendientes. Especie de elección Metodología de creación puesta a punto. Corto intervalo generacional Numerosos descendientes.

112 Ratón - Enfermedades genéticas: Knock-out o Knock-in. - Otras enfermedades: transgénicos clásicos

113 ¿Cómo hago un modelo para una enfermedad cuya causa sea que una proteína no se exprese?

114 Knock-out HEMOFILIA TIPO B WANG y cols. PNAS 94: , 1997.

115 ¿Cómo hago un modelo para una enfermedad cuya causa sea la sobreexpresión de una proteína?

116 Transgénico clásico DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Galbiati y cols. PNAS, Vol. 97, , 2000.

117 DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

118 Knock-out HEMOFILIA TIPO B WANG y cols. PNAS 94: , 1997.

119 ¿Cómo hago un modelo para una enfermedad cuya causa sea un número de copias de una region repetida superior a lo normal?

120 Knock-in ENFERMEDAD DE HUNTINGTON Lin y cols. Hum Mol Genet 2001 Jan 15;10(2):137-44

121 Knock-in ENFERMEDAD DE HUNTINGTON Lin y cols. Hum Mol Genet 2001 Jan 15;10(2):137-44

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123 Mouse Models for Human Disease

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129 3. Sanidad Xenotransplantes Candidata la especie porcina por... - Similitudes fisiógicas con humanos - Alta disponibilidad - Fácil cruzamiento. Problema: Combinación discordante que produce rechazo

130 3. Sanidad Xenotransplantes Transgénicos porcinos con expresión de D.A.F (expresión en corazón): - Proteína que inhibe la cascada del complemento Pruebas esperanzadoras transplantando el corazón a primates.

131 ? ? TERAPIA GÉNICA GERMINAL EN ANIMALES Transgénesis Enfermedades monogénicas candidatas.


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