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MicroRNAs microRNAs Silvia Juliana Serrano Gómez BSc, MSc Coordinadora FICMAC-Lab.

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Presentación del tema: "MicroRNAs microRNAs Silvia Juliana Serrano Gómez BSc, MSc Coordinadora FICMAC-Lab."— Transcripción de la presentación:

1 microRNAs microRNAs Silvia Juliana Serrano Gómez BSc, MSc Coordinadora FICMAC-Lab

2 Dogma central de la biología molecular T RANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN ARN: A cido R ibo n ucleico Tipos de ARN mARN: Mensajero Ribosomal RNA (rARN) tranferenciaRNA (tARN )

3 ADN Vs. ARN ACIDOS NUCLEICOS : Grupo fosfato, azúcar y base nitrogenada.

4 Transcipcion genica ADN molde Región de transcripción - Promotor Factores de transcripción ARN Polimerasa

5

6 Generación de mARN

7 Splicing del mRNA Generación de mARN

8 Traducción del ARN

9 Que es un microRNA? Familia de pequeños ARNs (Small RNAs) Secuencias de cadena sencilla no codificantes de ARN de aproximadamente 22 nucleotidos (nt) que regulan la expresión génica. Pasos para la generación de un microRNA 1. Gen codificante de microRNA Transcrito de 70nt 2. Pre-miRNA forma estructura de tallo-orquilla (Stem-loop) 3.Pre-miRNA es procedaso por DICER en un miRNA de 21 – 25nt

10 microRNAs Como regulan la expresión génica? 1.miRNA tiene complementariedad perfecta a secuencia target degradación del mRNA: RNAi INHIBICION A NIVEL TRANSCRIPCIONAL 2. Unión imperfecta del miRNA al mRNA INHIBICION A NIVEL POS-TRANSCIPCIONAL (TRADUCCION)

11 Como regular la expresión génica Biogénesis de los microRNAs RNAi Precursor largo RNAse III 70 nt RNAse III Regulación génica

12 Unión parcial por el 3UTR del mRNA

13 microRNAs Características Existen alrededor de 300 en el genoma (1-3% genes expresados) UNA DE LAS MAS GRANDES CLASES DE GENES REGULADORES Regulan diferentes procesos celulares Ciclo celular, diferenciación, desarrollo, metabolismo y enfermedades humanas (diabetes, desordenes inmunológicos, neurodegenerativos y cáncer) Aproximadamente el 50% se encuentran en sitios fragiles Regiones de amplificación: Asociados con cáncer Ubicación en el genoma Regiones intragenicas 50% en unidades de transcripción como intrones o exones de transcritos codificantes y no codificantes

14 Alteración en la expresión de los miRNAs Perdida de su función

15 Annu Rev Pathol ; 4: 199–227 D URANTE EL PROCESAMIENTO DEL MI RNA A LTERACIONES A NIVEL DE TRANSCRIPCIÓN

16 Supresores tumorales y oncogenes Bloquear transcripción de supresor tumoral NO-Bloquea transcripción de oncogén

17 Generalidades microRNAs en cáncer Secuencias corta de RNA (~22-5pb) Actúan a través que un complejo supresor (RISC) – Degradación del mRNA blanco – Represión de la traducción Un daño en le procesamiento del miRNA se puede traducir en predisposición a cáncer

18 microRNAs en gliomas

19 miRNAs y expresion en gliomas miR-21 Determinación de niveles de miR-21 Proliferación microvascular : Reorganización de la matriz extracelular y capacidad de proliferación qRT-PCRNorthern blot

20 Rutas moleculares afectadas por miR-21 Ensayos usando anti-miR-21

21 Blancos miR21 Apoptosis Proliferación Invasión Migración

22 En Apoptosis R UTA DE P 53 R UTA DE TGF Β Citoquina inhibidora del crecimiento Estabilizar p53

23 Ruta de metaloproteinasas de matriz (MMP) MMP: P EPTIDASAS – DEGRADACIÓN MATRIZ EXTRACELULAR N IVELES AUMENTADOS EN GLIOMAS

24 Ruta mediada por PDC4 E FECTOS SOBRE LA PROLIFERACIÓN

25

26 p53 JNY TOPORS TP53BP2 HNRPX DAXX JNY TOPORS TP53BP2 HNRPX DAXX p63 miR-21 Transcripción genes TGF β DAXX JNK miR-21

27 MMP TIMP3 RECK miR-21 p21 PDC4 p53 miR-21

28 mi-R21 y respuesta a quimioterapia (taxanos)

29 Señalización a través de factores de crecimiento en GMBs C ÉLULAS DE GLIOBLASTOMA U251 (PTEN mutado) LN229 (PTEN Silvestre) Perdida de PTEN: Peor Pronostico

30 Niveles de expresión de miR-21 por RT-PCR Regulacion de miR-21 por su inhibidor

31 Inhibidor del miR-21 incrementa la citotoxicidad del taxol Inhibición en un 50% del crecimiento celular Vs. Concentración taxol-inhibidor

32 Acción sobre AKT C ÉLULAS DE GLIOBLASTOMA U251 (PTEN mutado) LN229 (PTEN Silvestre) Perdida de PTEN: Peor Pronostico

33 Actividad de AKT: Contribuye a supervivencia Ensayos Western-Blot Reducción de la expresión de p-AKT usando combinación del inhibidor y quimioterapia Taxol Anti-miR-21 Taxol + Anti-miR-21 Taxol Anti-miR-21 Taxol + Anti-miR-21

34 miRNAs y apoptosis 6,24% 21,75% 18,74% 24,68% 21,97% Aumento de muerte celular por apotosis – Efecto aditivo

35 miR-21 y resistencia temozolamida

36 Ensayos de viabilidad celular Tratamiento con miR-21 hace células resistentes a tratamiento con TMZ

37 Ensayo de apoptosis TMZ: Induce apoptosis miR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis TMZ: Induce apoptosis miR-21: Disminuye porcentaje de apoptosis

38 Cascadas de señalización Bax/Bcl2 Bax: promotor de apoptosis, Bcl2: inhibidor de apoptosis Expresión relativa del radio Bax/Bcl2 Medición niveles Bax y Bcl2 por western blot Aumento relación Bax/Bcl2: Promueve apoptosis Disminución de la relación Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias Aumento relación Bax/Bcl2: Promueve apoptosis Disminución de la relación Bax/Bcl2 contribuyen a resistencia a terapias

39 miR-7 y proliferación Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFR Baja regulación de miR-7 en glioblastoma Primeros en reportar que miR-7 regula el EGFR Baja regulación de miR-7 en glioblastoma

40 EGFR PI3K AKT IRS1 IRS2 miR-7

41 Vía del EGFR-AKT

42 EGFR y AKT juegan un papel central en los Glioblastomas

43 Inmunoblot de EGFR Inmunoblot de AKT: fosforilación en Ser 173 Decrecimiento en la expresión de EGFR y de AKT

44 IRS-1/IRS-2 contienen sitios de unión del miR-7

45 INDEPENDIENTEMENTE miR-7 suprime la activación de AKT INDEPENDIENTEMENTE de la inhibición del EGFR EGFR regula la actividad de AKT PERO, la inhibición de AKT por miR-7 es dependiente de la inhibición de EGFR?

46 Conclusiones (1) Los microRNAs son molecular de cadena sencilla de aproximadamente 20 nt que regulan a expresión de diferentes genes Dos mecanismos de regulación: – iRNA – microRNA La gran mayoría de los miRNAs conocidos estas localizados en sitios frágiles asociados con cáncer Daños en el procesamiento del miRNA esta relacionado con el desarrollo de cáncer.

47 Conclusiones (2) A POPTOSIS mirR21 es un oncogén sobre-expresado en glioblastomas y se encuentra asociado con resistencia a agentes quimioterapéuticos A POPTOSIS P ROLIFERACIÓN CELULAR microRNA-7 (miR-7) es considerado un supresor tumoral que se encuentra sub-regulado en glioblastoma y suprime la expresión de EGFR y AKT P ROLIFERACIÓN CELULAR Representan un blanco terapéutico Uso de antagonistas


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