CITOQUININAS.

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1 CITOQUININAS

2 HISTORIA 1892 Weisner (Observaciones y Teorías) 1913/1921 Haberlandt
Sugiere existencia de compuesto que regula la división celular. 1913/1921 Haberlandt Extracto de floema induce división celular en parénquima de tubérculos de papa y heridas Si herida es lavada con agua, no se forma callo XLT: compuesto soluble Define término: totipotencia 1950 Skoog (U. Wisconsin) Estudiaba brotación de novo en tallos de tabaco cultivados in vitro Respuesta muy variable > in vitro shoots en medio de cultivo Prueba agua de coco – Steward at Cornell investiga componentes- que no interfiera Skoog 1500 m en Suecia 1932 contactó depto de Bioq reportan fracción de agua de coco x mas activa, estable a temp, no volatil, orgánico 1951 Carlos Miller Beca en grupo de Skoog. Busca en extracto de levadura actividad promotora de brotación. Encontró cultivo (botella) con alta actividad promotora en tallos de tabaco, no las otras, Observó que actividad precipitaba con AgNO3, igual q purinas y pirimidinas y probó estas individualmente pero no hubo resp. pero la duda persistió x reporte de skoog de auxinas + adenina promovían división. Probó diferentes fuentes de ADN entre ella Herring Sperm (arenque) y tenía alta actividad y precipitaba con AgNO3! Haberlandt fue un fisiólogo alemán Entre 1940 y 1950 se desarrollaban bases del cultivo de tejidos. Ya se había identificado a la auxina como compuestos importante en el desarrollo y crecimiento. Se observó que cultivos de callos de tabaco o raíces de zanahoria, que eran los modelos de moda, con nutrientes y auxina crecían poco al ser colocados en bloque de agar. Requerían de la adición de leche de coco (que se suponía contenía de todo lo necesario para el desarrollo del embrión (al ser un endospermo líquido) o de extracto de tejido vascular (por donde se transportan nutrientes), DNA autoclavado, Adenina o extracto de levadura. Skoog y Miller observaron que el esperma autclavado de peces ´producía un compuesto que identificaron como 6 furfuril amino purina que inducía división. Este compuesto fue denominado KINETINA. Mucho más activo que la adenina.

3 Se compró HS pero no tenía actividad
Se compró HS pero no tenía actividad. Cuando HS se puso “viejo” empezó a mostrar activdad. Probó si autoclavando favorecía el envejecimiento y así fue. El compuesto se logró purificar 1955 Miller et al Describen actividad en artículo. Y proponen ue se denomine kinetina. El grupo de Steward encontró en coco a difenilurea

4 Historia cont. ZEATINA 1957 Skoog y Miller
Proponen teoría del crecimiento y desarrollo: este es controlado por la relación de auxina y citoquininas (kinetina). Callos de tabaco. 1956 Skoog y Liberman Observan que kinetina aumenta el tamaño de las hojas 1958 Wickson y Thimann Observan que kinetina rompe dominancia apical en Pisum sativum y rompe letargo de semillas de lechuga, tabaco, trévol otros. 1962 Oberbeek and Loeffler Kinetina alarga vida de vegetales al reducir tasa de descomposición de proteínas 1963 Letham Australia y Miller en US primeros en aislar citoquinina de plantas, ambos en granos de maíz. Se continuó búsqueda de compuesto en endosperma de diferentes plantas pues este provee lo necesario para el crecimiento en las etapas iniciales. Se buscó en endosperma de coco, en maiz en frutos inmaduros de banano. Fue hasta 1963 que Letham en Australia y Miller en US aislaron una sustancia con actividad biológica de inducci´n de división a partir de granos de maiz y la llamaron ZEATINA. Luego se descubrieron otras sustancias y se produjeron compuestos sintéticos con esta misma actividad. Todos poseen una base de adenina pero con sustituciones en las cadenas laterales. Así se llega a una definición de las citoquininas. ZEATINA

5 Definición Sustancia que en presencia de una concentración óptima de auxina, induce división celular en cultivos in vitro de médula de tabaco

6 Bioensayos Inducción de división en células de médula de tabaco
Inducción de división en células de callo soya Expansión de células de cotiledones de rábano Inhibición de la senescencia medido por reducción de degradación de la clorofila.

7 Citoquininas naturales
Adenina Zeatina (trans y cis) Dihidro-zeatina Dimetilalil adenina (DMAA) Isopentenil adenina Distribución: En todas las plantas vasculares, hongos y algas.+

8 Citoquininas Naturales
Todas las ck naturales poseen un anillo de adenina, con una cadena isopentenil (5 carbones) en el N en posición 6. Este tipo de ck es definida como el tipo isoprenoides. Debido a que posee un enlace doble en la cadena lateral, existen isómeros (trans y cis) de la zeatina. Trans-zeatina, referida como zeatina, es la más común y abundante en la mayoría de las plantas. Es también la más activa, más que las cis. Al parecer el tipo de ck presente y más abundante varía según la planta.

9 Ribosido-Z Ribotido-Z
La adenina está presente en el ADN y sus derivados de ribosa (adenosina) y ribosa fosfato (adenosina monofosfato) son comunes en las plantas. La ribosa siempre está unida la N9 en el anillo de la adenina. Por lo tanto las citoquininas naturales también existen como devivados de azúcar: N9-ribósidos o N9-ribótidos. Las ck tambien se asocian a glucosa, xylosa y aa. Algunos autores se refieren a estas como ck naturales, otros los llaman derivados del ribosil o derivados ribosilados y los otros como conjugados. También ocurren como components de ciertos RNA de transferencia, en los cuales se encuentran en su forma ribosilada no como adeninas. trans zeatina 9 ribosido 2 metil tioisopentenil adenina 9 ribosido cis y trans 2 metiltiozeatina 9 ribosido Los tRNA son ricos en metilaciones, pero la posición de los ribósidos de ck es muy específica, a la par de la base 3´del anticodon. El rol de esta posición no es claro. tRNA

10 Citoquinas sintéticas
Kinetina Benzyl-adenina Tetrahydropyranyl-benzyl-adenina Ademas de la Kinetina, otros compuestos con gran actividad citoquinínica son: Benzyladenina, tiene un anillo de adenina y una cadena lateral en el N6, pero esta cadena lateral tiene un anillo aromático como en la kinetina. BA tiene la ventaja que es muy disponible en el mercado y barata. Ambos son compuestos estables porque no son degradados por CK-oxidasa. Los conjugados glicosilados tampoco se forman por la diferencias en las cadenas laterales pero si atacados por enzimas que forman derivados ribosilados y glucosidos N9 y N3. Kinetina y las Ck aromáticas se creían ausentes en plantas, pero al parecer si existen. Derivados de la fenilurea. Estos son activas cks, pero solo cien veces menos que BA. Su modo de acción no se conoce, se supone que es a través de la inactivación de la ck-oxidasa.

11 Anticitoquininas Existen compuestos denominados anticitoquininas, al usarse en dosis de 1 micromol inhiben respuesta inducidas por ck.

12 Actividad comparada

13 Factores de Sensibilidad
RECEPTIVIDAD cambio en número de receptores AFINIDAD cambio en receptores por modificaciones covalentes o cambios alostéricos causados por unión de una molécula al receptor CAPACIDAD DE RESPUESTA cambios en la cadena de eventos posteriores a la unión del RC al receptor EFICIENCIA DE ABSORCION cambios en el sistema de absorción de RC METABOLISMO degradación endógena

14 Sitios de síntesis Raíces Meristemos de raíz y tallo Cambium
Tejidos de almacenamiento (conjugados) Tejidos en crecimiento Semillas Frutos Yemas laterales Endospermo líquido

15 Biosíntesis

16 Ruta del Acido Mevalónico
Al igual que las giberelinas, los brassinoesteroides, carotenoides y ABA, el isopentenil difosfato es el origen de también para la síntesis de la citoquininas del tipo isoprenoide.

17 IPP se isomeriza con DMAPP y al unirse al AMP se origina el iPMP (isopenteniladenosine 5 monoP) y este es el precursor de todas las ck que ocurren naturalmente: zeatina mono P, y luego Zeatina (es un compuesto estable). No se conocen mutantes de la síntesis de CK o inhibidores de la síntesis de CK y por lo tanto las enzimas relacionadas con su síntesis no son bien conocidas. En bacterias la sintesis es más estudiada. Sintetizan ck a través de transferencia del DMAPP al 5´AMP. Las enzimas de esta transferencia del isopentenil están bien caracterizadas. En plantas: En ARBD se han identificado 9 isopenteniltransferasas , una de ella AtPT4 cataliza la transferencia de DMAPP a ATP y a ADP pero poco a AMP. Su sobreexpresión en ARBD causa ck respuestas y ck independencia por lo que pareciera que la ruta primordial es a través del ATP y no el AMP. Otra enzima AtIPT1 conjuga ADP o AMP con DMAPP. Los pasos precisos hasta Zea no son concidos pero se cree que es vía IPMP. Las reacciones de iPA a iP, de iPMP a ZMP y a ZR al parecer se ejecutan por enzimas genéricas que catalizan conversión de nucleótidos a nucleósidos y bases nitrogenadas. Existe la teoría de la síntesis de Zr independiente de iPMP, vía ATP, iPTP, ZTP, ZDP, ZMP y ZR. Esta teoría se apoya en el hecho que la enzima que cataliza unión de DMAPP a ATP y ADP ha sido descubierta en Arbd y su sobreexpresión causa una respuesta constitutiva a la ck.

18 Síntesis a partir de tRNA
En tRNA predomina isómero cis y en la planta predomina trans En callos de tabaco que no necesitan ck para crecer la tasa de degradación de tRNA-z no es suficiente para mantener el nivel de ck libre observado Existe evidencia de que ck no se sintetizan a partir de degradación del tRNA

19 Conjugación Combinación reversible de citoquininas con diferentes compuestos y se usan en momentos específicos Se almacenan en vacuolas y/o ret. endopl. Compuestos son transportables Tipo de conjugación depende de especie y de etapa del desarrollo Se puede combinar con: Glucosa, ribonucleósidos y ribonucleótidos

20 Conjugación Intermediarios en síntesis?
Al adicionar zeatina marcada rápido se convierte en N9-ribósidos o ribótidos, los cuales son interconvertibles entre sí. Z es la forma activa. Estas formas también son intermediarios de síntesis de Z. Como se regula este nivel es aún poco comprendido. Azúcares como la xilosa y la glucosa se pueden conjugar a través del grupo OH, formando O-glicósidos. Esta es la forma más común de almacenamiento. Ocurre a través de glicosil transferasas que ya se han clonado en especies como el frijol. Por su polaridad se cree que se almacenan en la vacuola. O-glicosidasas remueven el azúcar. Grupo glicósido protege de degradación de la ck por la ck-oxidasa.

21 Catabolismo Remoción irreversible de citoquininas
Vía Citoquinina oxidasa Oxidación de la cadena lateral en el nitrógeno. La enzima requiere un doble enlace en la cadena lateral para cortar por lo que sus substratos son la Zea y la isopentenil adenina y sus derivados ribosilados., no en dihidrozeatina. También es inactiva contra los O-glicósidos, BA y Kin que tiene cadenas laterales aromáticas. La Ck-oxidasa se eleva en plantas con alto contenido de ck adicionado., también en plantas transformadas con gen ipt de Agrobacterium, lo que indica que esta enzima es activada por su propio sustrato, un buen ejemplo de una retroregulación negativa. La actividad de la ck-oxidasa varía en diferente plantas. En rabano su actividad es mínima y el catabolismo es mayor vía n7 y n9 glicosilaciones. En maiz, las N9 glicosilaciones son más comunes. La actividad de la ck oxidasa aumenta cuando el tejido pierde su capacidad de división y crecimiento disminuye. Por ejemplo en granos de maíz su actividad aumenta al irmadurando los granos. El gen de la Ck-oxidasa se clonó en maiz: CKX1. Es una oxidoreductasa y requiere FAD (Flavin adedina dinucleotido) y 02 molecular para actuar. También aislado de arbd. Are these genes also regulados a nivel de TC y TL. + Isopentenil adenina adenina 3 metyl-2-butenal Citoquinina oxidasa

22 N-conjugación Conjugación en N7 o N9. Esta glicosidación ocurre principalmente por la actividad de glucosiltransferasas especificas, diferentes de las O-glicosiltranferasas, pero esto no es claro aún.

23 ZEATINA UREA

24 Transporte Ribonucleótido de zeatina Bidireccional
Forma más común de transporte Bidireccional

25 Isopentenylpirofosfato
Homeostasis Auxina Precursores de citoquinina AMP Isopentenylpirofosfato Citoquininas activas Conjugados inactivos Zeatina, ribosido de Z Isopentenyladenina Isopentenyladenosina 7 y 9 N-glucósidos O-glucósidos B-glucosidasa La regulación de el nivel de ck es esencial para mantener un crecimiento ordenado. Evidencia de esto son las plantas que sobreproducen ck. No se conocen mutantes de síntesis. Mutante sobreproductor de ck, amp1, tiene 5 a 6x la concentración normal de ck: Multiples cotiledones (solo esta caract no se observa en las plantas transformadas con IPT) Sobreproducción de ramas laterales Desarrollo radical retrazado Senescencia retardada Metabolitos Inactivos Adenina y derivados de adenina Ck oxidasa Auxina Conjug. de Auxina

26 Efectos Fisiológicos En combinación con auxinas regulan la relación parte aérea:raiz Regula dominancia apical Activa crecimiento de yemas laterales Induce división celular Induce formación de órganos in vitro Retarda senescencia de hojas En combinación con etileno y luz regula el crecimiento de dicots en la oscuridad

27 División Celular Auxina Auxinas Citoquininas Sacarosa
Señales específicas Regulación metabólica Agostino y Kiever, 1999

28 División celular y giberelinas
mRNA de cdc activada por Giberelinas mRNA de ciclina Síntesis de DNA Acumulación de células en G2 Alista células para entrar a M

29 Citoquininas y morfogénesis
A. Reyes

30 Senescencia

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32 Agrobacterium tumefaciens

33 Otros efectos fisiológicos
Estimula pérdida de agua por transpiración Elimina dormancia en algunas semillas Estimula formación de tubérculos

34 Genética Molecular Respuesta molecular asociada al crecimiento
Receptor Transducción Respuesta Rápida Bomba de protones Secreción Respuesta Lenta Activación de proteínas reguldoras Síntesis de mRNA Síntesis de proteínas de crecimiento

35 Sistema de dos componentes
Kakimoto, 2003

36 Genes asociados a auxinas

37 Structures of cytokinin receptors and other proteins of the cytokinin signalling pathway. Amino acids that participate in the phosphorelay are circled. Other characteristic consensus motifs are also indicated. Mutations that lead to loss of function in CRE1/AHK4 are shown below the CRE1/AHK4 structure [17,20]. Abbreviations: aa, amino acids; AD, acidic domain; CHASE, cyclases/histidine kinases associated sensory extracellular; GARP, DNA-binding motif; HK, histidine kinase; LB, putative ligand binding domain; NLS, nuclear localisation signal; OD, output domain; RD, receiver domain; RLD, receiver-like domain; TM, transmembrane domain. Domains are according to [12,27,34,38]. A longer open reading frame of CRE1 coding for additional 23 amino acids at the N-terminal end was also identified Structures of cytokinin receptors and other proteins of the cytokinin signalling pathway. Amino acids that participate in the phosphorelay are circled. Other characteristic consensus motifs are also indicated. Mutations that lead to loss of function in CRE1/AHK4 are shown below the CRE1/AHK4 structure [17,20]. Abbreviations: aa, amino acids; AD, acidic domain; CHASE, cyclases/histidine kinases associated sensory extracellular; GARP, DNA-binding motif; HK, histidine kinase; LB, putative ligand binding domain; NLS, nuclear localisation signal; OD, output domain; RD, receiver domain; RLD, receiver-like domain; TM, transmembrane domain. Domains are according to [12,27,34,38].
A longer open reading frame of CRE1 coding for additional 23 amino acids at the N-terminal end was also identified [7]

38 Kakimoto, 2003 Tipo B: activador de TC no influenciado por ck
Tipo A: represor de TC, influenciado por ck Type A no fosforilado inhibe la TC inducida por Tipo B, su fosforilación permite TC de Tipo B. Tipo B sintetiza Tipo A (autoregulación) ARR: arabidopsis response regulator Kakimoto, 2003

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42 Fig. 1. Model for the cytokinin multistep two-component circuitry through histidine (H), and aspartate (D) phosphorelay, involving histidine-kinase receptors (HK), phosphotransfer proteins (HPT), a “pseudo–HPT” with an asparagine (N) instead of the D, and A-type and B-type RRs. Each signaling step is executed by a family of genes that largely act redundantly, as illustrated. B Müller, J Sheen Science 2007;318:68-69