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Paredes celulares procariotas (3) Biosíntesis del PG. Protoplastos y esferoplastos. Formas L.

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Presentación del tema: "Paredes celulares procariotas (3) Biosíntesis del PG. Protoplastos y esferoplastos. Formas L."— Transcripción de la presentación:

1 Paredes celulares procariotas (3) Biosíntesis del PG. Protoplastos y esferoplastos. Formas L

2 Cómo sintetizar un sáculo cerrado fuera del protoplasto El PG es una estructura cerrada Pero debe de crecer Debe de abrirse de algún modo controlado para incorporar nuevo material Debe facilitar el proceso de división en dos células hijas, a partir de un septo ¿Cómo transportar una macromolécula tan grande al exterior? ¿Cómo se resuelve el aporte de energía para la biosíntesis en el exterior del protoplasto?

3 Biosíntesis del PG: visión de conjunto 1. Síntesis de precursores solubles en el citoplasma 2. Los precursores son recogidos por un transportador de membrana y se forman las uu. disacarídicas con el pentapéptido 3. Las uu. disacarídicas-(pentapéptido), expuestas al exterior, son polimerizadas cadenas lineales de PG 4. La cadena lineal de PG recién formado se une al PG preexistente por transpeptidación

4 Fase 1 (en el citoplasma) Activación de los monosacáridos: UDP-NAG UDP-NAG + PEP UDP-NAM Unión secuencial aa. al NAM (con ATP y Mn): NAM-L-ala NAM-L-ala-D-glu NAM-L-ala-D-glu –di aa (m-DAP, L-Lys) NAM-L-ala-D-glu –di aa-D-ala-D-ala Al final de esta fase tenemos en citoplasma: UDP-NAG UDP-NAM-(pentapéptido)

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6 Fase 2: formación unidad disacarídica-pentapéptido (a) El NAM-(pentapétido) se transfiere desde el UDP hasta el bactoprenol-P bactoprenol-P-P-NAM- (pentapéptido )

7 Fase 2: formación unidad disacarídica-pentapéptido (b) El NAM-(pentapétido) se transfiere desde el UDP hasta el bactoprenol-P bactoprenol-P- P-NAM-(pentapéptido) Ahora se transfiere la NAG desde el UDP para unirse por transglucosidación con el NAM. Tenemos, pues: bactoprenol-P-P- NAM(pentapéptido)-NAG Bactoprenol está en membrana citoplásmica. NAM(pentapéptido)-NAG está en principio colgando hacia el citoplasma, pero ahora...

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9 Fase 3: transglucosidación y producción de PG lineal... El bactoprenol cargado con la unidad NAM(pentapéptido)-NAG se va al otro lado de la membrana (flip-flop), con lo que la unidad queda expuesta hacia el exterior Transglucosidación: dos unidades de bactoprenol-P- P-NAM(pentapéptido)-NAG reaccionan Queda libre un bactoprenol-P-P ( bactoprenol-P, por fosfatasa específica) Queda un bactoprenol-P-P unido a dos unidades de NAM(pentapéptido)-NAG La reiteración de transglucosidación va generando cadenas largas de PG naciente unido por un extremo a bactoprenol

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11 Fase 4: transpeptidación: creación de PG entrecruzado El PG naciente (con sus pentapétidos) unido al bactoprenol reacciona por transpeptidación con un PG aceptor preexistente: El –CO de la D-ala(4) reacciona con el NH2 libre del di-aa(3) Entrecruzamiento entre dos cadenas de PG Se libera la D-ala(5)

12 Detalle de la reacción de transpeptidación

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14 Antibióticos que actúan sobre la biosíntesis del PG Fosfomicina: inhibe la formación de NAM a partir de NAG Cicloserina: inhibe la racemización de la Ala, así como la formación del dipéptido D-ala-D-ala Tunicamicina: inhibe la traslocasa (2ª fase) Vancomicina: inhibe transglucosidación (3ª fase) Bacitracina: impide la regeneración del bactoprenol ß-lactámicos: inhiben transpeptidación (fase 4ª: entrecruzamiento de cadenas de PG

15 Crecimiento de pared celular: papel de las autolisinas Para que el PG crezca coordinadamente y se pueda formar el septo transversal, hay una serie de enzimas: autolisinas Muchas autolisinas son sitios de acción de penicilinas BPBs PBP1: síntesis de PG durante elongación PBP2: crecimiento forma bacilar PBP3: síntesis de PG en el tabique transv. PBP4: hidrólisis entrecruzamientos en elongación PBP5: destrucción pentapéptido no entrecruzado

16 Crecimiento pared en Gram- negativa (E. coli) Crecimiento en longitud (elongación) la célula crece en tamaño Producción del tabique transversal (septación) formación de 2 células hijas

17 Elongación de la pared en Escherichia coli Las PBPs1 se encargan de la elongación del PG naciente: Transglucosidación de uu. disacarídicas Transpeptidación entre tetrapéptidos de cadenas adyacentes Las cadenas nacientes de PG se intercalan en el PG preexistente: PBP4 y PBP5 cortan enlaces del PG previo PBP2 interviene en la transpeptidación La elongación se hace en la parte cilíndrica de la célula, en forma dispersa (˜200 puntos)

18 Septación de la pared en Escherichia coli Ensamblaje del divisoma por debajo de la membrana, en el centro del bacilo (modelo aún hipotético): FtsZ (parecida a tubulina) se ensambla, formando un anillo citocinético que tira de las envueltas hacia el interior Luego se activa la PBP3(=FtsI), una transglucosidasa/transpeptidasa del septo Otras proteínas Fts

19 Crecimiento y septación de PC en Enterococcus faecalis El crecimiento de la PC es zonal: comienza en centro y avanza hacia fuera 1. Célula adulta con banda ecuatorial donde la PC se hace más gruesa 2. Debajo de este engrosamiento, se va depositando nuevo material de PC. Aparece una muesca en banda ecuatorial 3. El tabique (doble grosor de PC normal) avanza hasta que se completa 5. El tabique de doble grosor se escinde simétricamente por autolisinas

20 Crecimiento zonal de la PC del Enterococcus faecalis

21 Protoplastos y esferoplastos En laboratorio se pueden lograr células desprovistas total o parcialmente de PC Protoplastos: células procarióticas carentes totalmente de pared celular Esferoplastos: células procarióticas carentes parcialmente de pared celular

22 Métodos de obtención de protoplastos y esferoplastos Por destrucción del PG con lisozima o peptidasas En Gram-negativas hay que desorganizar antes la membrana externa con el agente quelante EDTA (secuestra cationes) Por inhibición de la formación de nuevo PG en células en crecimiento Ej.: tratando las células con penicilina

23 Protoplastos y esferoplastos son osmóticamente sensibles

24 Suspensiones estables de protoplastos y esferoplastos Hay que obtenerlos en un medio isotónico o ligeramente hipertónico: NaCl M Sorbitol o sacarosa M Polietilenglicol (PEG) al 7.5% En estos medios protoplastos y esferoplastos tienen formas esféricas, cualquiera que fuera la forma original de la bacteria En medios adecuados, protoplastos y esferoplastos pueden regenerar la PC

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26 ¿Para qué sirven los protoplastos y esferoplastos? Método suave de obtener extractos libres de células y fracciones subcelulares Para hacerlas permeables a ADN, en experimentos de transformación artificial (ej.: en ingeniería genética) Fusión de protoplastos (para obtener recombinantes somáticos)

27 Formas L Formas L naturales: Carentes totalmente (o casi) de PC que algunas bacterias generan espontáneamente en medios a base de suero (que son hipertónicos) Ejemplo: Streptobacillus moniliformis Colonias en forma de huevo frito Formas L inducidas: tratamiento con penicilina en medio hipertónico L inestables: tratamiento breve; revierten PC L estables: tratamiento prolongado; no revierten PC


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