2016 – Lic. Darío Paladini.  Análisis de la función en la célula huésped, estudios de localización, etc.: no se requiere purificación.  Estudios de.

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1 2016 – Lic. Darío Paladini

2  Análisis de la función en la célula huésped, estudios de localización, etc.: no se requiere purificación.  Estudios de la proteína in vitro, cristalografía, espectroscopía, producción de anticuerpos, etc.: producción a baja y mediana escala.  Producción de la proteína a gran escala: por ejemplo para comercialización.

3  Elección de la secuencia a clonar  Elección del vector apropiado y del huésped apropiado  Cómo optimizar la expresión de la proteína de interés  Método correcto de extracción y clarificación  Esquema de purificación  Correcto almacenamiento de la proteína purificada

4  Bacterias: Escherichia coli. Simple, barato y veloz. Muchos vectores y cepas comerciales. Eucariotas  Levaduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis.  Células de insecto: Sf9, Sf21 (tejido de ovario de la pupa de Spodoptera frugiperda) mediante baculovirus. Modificaciones post-traduccionales más complejas, mejor plegado.  Células de mamíferos: mediante plásmidos, adenovirus, retrovirus, etc. Cultivo con muchos requerimientos.  Animales y plantas transgénicos

5  Tamaño:  Tamaño: las proteínas citosólicas pequeñas ( 100 aas. Son problemáticas en cualquier sistema. En E. coli suelen ser inestables y formar cuerpos de inclusión insolubles.  Cantidad:  Cantidad: Si se necesita mucha cantidad conviene explorar varias combinaciones vector/huésped/esquema de inducción/esquema de purificación.  Actividad:  Actividad: No es necesaria (ej. producción anticuerpos), entonces sirven los cuerpos de inclusión o los tags para purificación por afinidad. Actividad necesaria, es importante mantenerla o re-establecerla; la facilidad de la purificación se vuelve secundaria.  Estudios estructurales:  Estudios estructurales: Es mejor expresarla como proteína soluble (minimizar el mal plegamiento y la desnaturalización in vitro).

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7  Promotor: o lac: pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, etc. Represor lac, inducible por IPTG: isopropil-ß-D- tiogalactósido (muy costoso). Vectores diseñados para selección de colonias azules/blancas por interrupción del gen de la ß-galactosidasa. No tan fuerte pero en plásmidos de alto nº de copias los niveles de expresión son respetables. Expresión en E. coli

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9 Bacteria huésped que lo expresa o incluido en el plásmido IPTG: no metabolizable X-gal: 5-bromo-4-cloro-3- indolil-β-D-galactopiranósido

10  Promotor: o tac y trc: pTrcHis-TOPO®, pGEX Fuerte. Fusiones entre promotores trp (región -35) y lac (región -10), éstos son regulados por el represor lac. Son 3 veces más fuertes que trp y 10 veces más fuertes que lac Expresión en E. coli