BIORREMEDIACIÓN DE HIDROCARBUROS CON MICROORGANISMOS ANTÁRTICOS Variación de ln UFCs en pruebas experimentales a diferentes temperaturas.

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1 BIORREMEDIACIÓN DE HIDROCARBUROS CON MICROORGANISMOS ANTÁRTICOS Variación de ln UFCs en pruebas experimentales a diferentes temperaturas

2 ANTECEDENTES Derrame de OCP en el 2003, en la laguna de Papallacta. Trabajos de remediación mal ejecutados. Juicio EMAAPQ- Ecuavital Declaratoria de pasivo ambiental. Participación en la XIV Misión Científica a la Antártida 2010

3 OBJETIVOS Aislar e identificar microorganismos antárticos con capacidad para degradar hidrocarburos. Ejecutar pruebas de biorremediación en laboratorio e in situ (en La Estación Científica Pedro Vicente Maldonado) Estudio de dinámica poblacional y de variación de ln Ufc

4 ETAPAS Búsqueda y aislamiento Pruebas de biorremediación Estudio comparativo Obtención de híbridos Misiones antárticas En Ecuador, cuarto frío En Maldonado in situ Nueve cepas microbianas En Ecuador, Papallacta Microorganismos andinos Microorganismos antárticos Identificación molecular Banco de cepas Recuperación de Papallacta

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6 MATERIALES Y MÉTODOS Pruebas de laboratorio Siembra por diluciones en agar nutritivo, agar sangre, agar chocolate y PDA. El medio de identificación fue un medio sintético con sales minerales y una fuente de carbono de hidrocarburos, sugerido por Eriksson, 2002. Los nutrientes del suelo (C, N, P) se evaluaron mediante el uso de los métodos propuestos por Cleveland y Liptzin., (2007).

7 MATERIALES Y MÉTODOS La metodología de tratamiento empleada fue la de terrario, en bandejas de plástico de 20kg (un total de 10). A los suelos se adicionó crudo de 18 grados API disueltos en acetona, en tal forma que los 20 kg de suelos estériles adquieran una concentración de 5000ppm en TPHs y 850 ppm en HAPs, conforme al análisis inicial de la composición del crudo empleado.

8 MATERIALES Y MÉTODOS En cada una de las celdas experimentales, excepto la testigo, los microorganismos se adicionaron con la solución nutritiva a razón de 15ml/kg, por tres ocasiones; al inicio a los 30, y 60 días.

9 MATERIALES Y MÉTODOS Pruebas de campo Se seleccionaron seis bandejas de plástico, impermeabilizarlas con ayuda de láminas de polietileno. En cada una de ellas se depositaron 20 kg de suelo de las inmediaciones de la Estación Maldonado.

10 MATERIALES Y MÉTODOS Los microorganismos se inocularon a razón de 15ml/kg de suelo, en cada una de las celdas experimentales. Los suelos fueron contaminados con 15000 ppm de TPHs, (diesel, y gasolina) y con 5000 ppm HAPs, (benceno).

11 MICROORGANISMOS EMPLEADOS CÓDIGOREINOFILOORDENFAMILIAGÉNEROESPECIE BM7BacteriaProteobacteriaPseudomonadalesPseudomonadaceaePseudomonasPseudomonas sp BM6BacteriaActinobacteriaActinomycetalesNocardiaceaeRhodococcusRhodococcus sp MM2BacteriaProteobacteriaPseudomonadalesPseudomonadaceaePseudomonasPseudomona putida PM5BacteriaFermicutesBacillalesBacillaceaeBacillusBacillus sp MM1BacteriaFermicutesClostridialesClostridiceaeClostridiumClostridium perfrigens BM6BacteriaActinobacteriaActinomycetalesMicrococcaceaeMicrococcusMicrococcus antarticus PM5BacteriaProteobacteriaSphingomonadalesSphingomonadaceaeSphingomonasSphingomonas sp

12 MUESTREO Y SIEMBRA

13 Puesta del experimento 2012

14 Verificación 2013

15 Metodología de análisis ln Ufc a 4°C, 15°C por diluciones y por siembras directas Toma de muestras de alícuotas de las celdas en tratamiento. Siembras directas y conteo en placa. Cultivo a 4ºC y a 15ºC Uso de medio AN

16 RESULTADOS LABORATORIO ECUADOR Durante nuestro trabajo su comportamiento fue irregular, logrando en la mayoría de las celdas un crecimiento moderado. Los valores variaron entre 0,08x10 6 de Micrococcus antarticus y 3,7x10 6 de Rhodococcus sp. La tabla No.1, ilustra el comportamiento de éste parámetro durante las pruebas en cada una de las celdas experimentales.

17 Variación de ln en laboratorio- Ecuador Cepa microbianaUnidad Expln 1ln 2ln 3ln 4ln 5 Pseudomonas spU13,4011,2813,1411,4013,56 Rhodococcus spU23,0413,9114,4014,7715,12 Pseudomona putidaU33,2113,4512,8913,5913,76 Bacillus spU42,7010,8113,7113,4513,81 Clostridium perfrigensU52,1910,3012,2013,1213,64 Aspergillum nigerU63,7113,5913,7314,1514,34 Penicillum ChrysogenumU74,1413,4513,7313,9113,99 Micrococcus antarticusU81,799,9010,5910,8111,28 Sphingomonas spU92,4810,3011,2813,4113,78 TestigoUT1,09 1,601,941,79

18 RESULTADOS De la tabla se deduce que la especie Rhodococcus presento una mayor variación de ln Ufc, que significó una elevada tasa de degradación de hidrocarburos, especialmente aromáticos, de igual forma en Bacillus sp y Pseudomona pútida (Gualoto., 2011).

19 RESULTADOS La tendencia de ln Ufc, bajo estas condiciones es al incremento, lo que en la práctica se traduce en un incremento en la biodegradación de hidrocarburos (Gualoto., 2011). El número de microorganismos degradadores de hidrocarburos en suelos vírgenes polares a menudo está bajo los límites de detección, mientras que 10 5 degradadores de hidrocarburos g -1 se han detectado en los suelos contaminados en las aguas superficiales y capas subsuperficiales (Rike et al 2002). Tomando en consideración dicha fuente, estimamos que nuestros resultados, confirman dicha abundancia

20 Variación de ln en pruebas de laboratorio

21 Variación de ln, in situ PEVIMA HidrocarburoCELDA MUESTREO ln 1ln 2ln 3 1 Gasolina PBR-1-G3,462,482,30 PBR-R-1-G2,392,70 2 Diesel PBR-2-D3,632,832,30 PBR-R-2-D3,093,782,89 3 Benceno PBR-3-B4,213,853,33 PBR-R-3-B0,004,552,99 4TESTIGO2,563,552,48

22 Variación de ln en pruebas de campo

23 RESULTADOS Debido a lo limitado del tiempo real disponible para el control del proceso de biorremediación en la Estación Maldonado, el número de controles de Ufc, es menor que en las pruebas de biorremediación en Ecuador y en un período menor de tiempo. Para Ecuador fueron 120 días y para la Antártida apenas 21 días.

24 RESULTADOS Adicionalmente las celdas experimentales no recibieron fuentes adicionales de carbono ni de N y P, considerando que estos son naturalmente escasos en la Antártida y que bajo estas condiciones se desarrollarán los futuros trabajos de biorremediación in situ (Kevin M. et al., 2013).

25 RESULTADOS Otra diferencia sustancial entre las pruebas es, el uso de hidrocarburos de bajo peso molecular en vez de crudo, debido a la imposibilidad de transportar crudo a la estación, razón por lo que se emplearon los hidrocarburos presentes en Maldonado. La celda experimental PBR-3-B, que corresponde a la muestra con benceno que es un hidrocarburo aromático, presenta un valor elevado de ln Ufc, lo que sugiere una levada actividad del género Rhodococcus, similar al observado en pruebas de laboratorio.

26 RESULTADOS Los valores de ln de las pruebas de campo son aproximadamente 4,5 veces menores que los obtenidos en condiciones de laboratorio.

27 Variación de Ufc a 15 °C, siembra por diluciones vs directa CELDADiluciones lnDirecto ln 13,394,44 23,055,73 33,434,53 42,333,37 52,814,02 62,533,82 TESTIGO1,682,72

28 Variación Ufc a 4°c, siembras directas Vs diluciones CELDALn DilucionesLn Directo 11,832,14 22,413,26 33,231,81 41,092,43 51,382,92 61,472,99 71,551,91

29 Comparativo ln Ufc 15°C vs °4C, siembra directa y por diluciones

30 Resultados, siembras a 4°C y a 15°C, por siembras directas y por diluciones Las diluciones empleadas fueron de 10 -1 y 10 -2 En todas las celdas invariablemente las siembras directas muestran un valor de ln Ufc superior a las siembras por dilución. El valor de ln Ufc de las siembras a 15°C, son superiores a los valores de Ufc a 4°C.

31 Resultados, siembras a 4°C y a 15°C, por siembras directas y por diluciones El valor promedio de ln Ufc de las siembras por diluciones a 15°C es 1,48 veces superior al valor de ln Ufc de las siembras por diluciones a 4°C. El valor promedio de ln Ufc de las siembras directas 15°C es 1,64 veces superior al valor de ln Ufc de las siembras directas a 4°C.

32 Resultados, siembras a 4°C y a 15°C, por siembras directas y por diluciones Las siembras directas a 4°C son superiores en 1,34 veces a las por dilución. Las siembras directas a 15°C son superiores en 1,48 veces a las por dilución.

33 CONCLUSIONES Los resultados obtenidos demuestran que las variaciones en ln de Ufc de las pruebas de laboratorio en Ecuador a 4°C, tienden al incremento. Los valores de ln de las pruebas de campo (Antártida) son aproximadamente 4,5 veces menores que los obtenidos en condiciones de laboratorio. Los valores de las variaciones de ln Ufc de las pruebas de campo muestran que los factores ambientales son decisivos y ejercen una influencia directa sobre este parámetro. (Gualoto., 2013).

34 CONCLUSIONES Un incremento en la temperatura promedio ambiental, como consecuencia del calentamiento global, modificaría sustancialmente ln de Ufc, por el metabolismo acelerado de las escazas fuentes de carbono en el entorno antártico. Así lo ratifican las siembras a 15°C, con valores de ln promedio de 4,09 y de 2,75 para siembras directas y por diluciones. El calentamiento global favorecerá al incremento de la tasa de biodegradación de hidrocarburos y a la activación de los microorganismos autóctonos.

35 CONCLUSIONES La temperatura es un factor determinante para el incremento de ln Ufc. La tasa de degradación de hidrocarburos es directamente proporcional a ln Ufc.

36 RECOMENDACIONES Ampliar el tiempo de control de ln Ufc en condiciones de campo y verificar su relación con la constante de degradación de los hidrocarburos. Modelar proceso de biorremediación con microorganismos antárticos a distintas temperaturas, con adición de fuentes de N, P y K. Medir la actividad microbiana a través de la cantidad de CO 2 generado e inferir el aporte de la degradación microbiana al calentamiento global.

37 RECOMENDACIONES Verificar si las colonias identificadas en los trabajos de campo, corresponden a las inoculadas, mediante técnicas de Biología molecular por secuenciación de genes 16S rRNA. Basados en estos resultados inferir la existencia de especies indicadoras del calentamiento global, en función de su presencia, ausencia y el valor de lnUfc.

38 BIBLIOGRAFÍA Aislabie J, Broady P, Saul D (2006b). Viable heterotropic bacteria from high altitude, high latitude soil of La Gorce Mountains (86_300S, 147_W), Antarctica. Antarct Sci 18:313–321. Aislabie JM, Chhour K, Saul DJ, Miyauchi S, Ayton J, Paetzold RF, Balks MR (2006a) Dominant bacterial groups in soils of Marble Point and Wright Valley, Victoria Land, Antarctica. Soil Biol Biochem 38:3041– 3056 Gualoto. M., (2011). Biorremediación de hidrocarburos utilizando cepas antárticas. Ecuador en la Antártida, Historia, perspectivas y proyecciones. IAN.2011.

39 BIBLIOGRAFÍA Gualoto. M., (2013). Informe de campo XVII Misión Científica a la Antártida. Jinbo Xiong. Huaibo Sun, Fei Peng. (2014). Characterizing changes in soil bacterial ommunity structure in response to short-term warming. FEMS Microbiol Ecol. 1–13. Kevin M. Geyer, Adam E. Altrichter, Cristina D. Takacs-Vesbach, David J. Van Horn, (2014). Bacterial community composition of divergent soil habitats in a polar desert. FEMS Microbiol Ecol: 1–5

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