Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal.

Presentación del tema: "Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal."— Transcripción de la presentación:

1 Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal.
Introducción. Bases fundamentales para la creación de organismos modificados genéticamente (OMG). OMG aplicados a la cría y salud animal. Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal.

2 BIBLIOGRAFÍA INTERNET LIBROS GENERALES
- Griffiths, A.J., Gelbart, W.M., Miller, J.H. y Lewontin, R.C. Genética Moderna, 2000. - Strachan, T., Read, A.P. Genética Molecular Humana, 1999. - Klug, W.S. y Cummings, M.R. Conceptos de Genética, 1998. INTERNET -Transgénesis en mamíferos -The Jackson Laboratory -Buscador general Terapia génica. and

3

4 Animal transgénico para la Esclerosis Lateral Amiotrófica

5 DE MENDEL A LA CLONACIÓN...

6 1865-1940 Genética de la transmisión.
Mecanismos de acción génica DNA recombinante Genética inversa Transgénesis y Terapia Génica Chips de ADN Clonación de un mamífero. Genoma Humano/Células madres humanas.

7 Pero ,¿qué necesitaremos recordar?

8 Estructura de un gen Intrones Exones RNA (cDNA) PROMOTOR PROTEÍNA

9 Organismos modificados
genéticamente

10 ¿ Qué son los organismos modificados genéticamente?
(Directiva 90/220/CEE) Cualquier organismo cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o en la recombinación natural.

11 La transgénesis, es decir, el diseño de un genotipo específico mediante la adición de DNA exógeno a un genoma, supone una ampliación de la mejora génética clásica,tanto para la investigación básica como con fines comerciales. (Griffiths y cols, 2002)

12 Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría y salud animal.
Bases fundamentales para la creación de organismos modificados genéticamente (OMG). - Qué vamos a insertar: Azar o recombinación homóloga. - Cómo lo vamos a insertar OMG aplicados a la cría y salud animal. - ¿Dónde? Y ¿Para qué?

13 Al azar TRANSGÉNESIS Recombinación homóloga

14 TRANSGÉN GEN GENOMA

15 Al azar TRANSGÉN GEN Concatémeros Gen crucial Zonas metiladas

16 Muerte celular

17 ¿TRANSGÉN? CONSTRUCCIÓN GENÉTICA
(Normalmente plásmidos, ahora otros vectores también) Gen de resistencia a antibióticos (normalmente Ampicilina) con promotores procariotas El ADN que queremos insertar

18 ¿De qué constará el ADN que queremos insertar?
Expresión Localización de la expresión Regulación de la expresión. cDNA, DNA genómico. Promotor. Enhancer, elementos cis y trans.

19 Transgén simple Promotor as1-antitripsina b-lactoglobulina humana
bovina as1-antitripsina humana

20 ¿Por qué no lo pones en la pizarra que nos enteraremos más?

21 Recombinación homóloga TRANSGÉN GEN TRANSGÉN

22 Para poder realizar la recombinación homóloga son necesarias células en cultivo

23 Términos utilizados Knock-out: (fuera de combate) Knock-in:
Animal creado mediante recombinación homóloga para evitar la expresión de un gen. Knock-in: Animal creado mediante recombinación homóloga para que un gen se exprese bajo el promotor que deseemos.

24 ¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa?
-Zona homólogas al gen de interés. -Resistencia a antibióticos/mismo gen: - Kanamicina (procariotas) - Neomicina (eucariotas) Knock-out Knock-in -Opcional: - Gen marcador - Gen de expresión.

25 Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO Promotor p DNA M Gen marcador R Resistencia CONSTRUCCIÓN GENÉTICA

26 Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO DNA M Gen marcador R Resistencia Promotor p CONSTRUCCIÓN GENÉTICA

27 Recombinación homóloga
GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO DNA M Gen marcador R Resistencia Promotor p CONSTRUCCIÓN GENÉTICA

28 Más pizarra

29

30

31 RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA
TRANSGÉNESIS AL AZAR TRANSGÉNESIS POR RECOMBINACIÓN HOMÓLOGA Directamente en el embrión En cultivos celulares En cultivos celulares

32 CULTIVOS CELULARES Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el embrión u óvulo

33 MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN

34 IN VIVO IN VITRO DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.
REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

35 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

36 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

37 ESPERMATOZOIDES Esponda, P. C.B.I. y C.S.I.C

38 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

39 Biolística o método de bombardeo.

40 HA SIDO MUY UTILIZADA EN PLANTAS
Biolística o método de bombardeo. Partículas de tungsteno u oro Descarga con helio. Características: Capacidad de introducción limitada. HA SIDO MUY UTILIZADA EN PLANTAS

41 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

42 MICROINYECCIÓN Microinyección en el pronúcleo masculino.
Microinyección en el citoplasma del huevo. Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.)

43 ¿Qué necesitamos para realizar la microinyección?
Transgen Cigotos Introducir el transgén en el cigoto Desarrollar el embrión Construcción al azar. Animales donadores. Micromanipulador. Madres receptoras

44 ¿Como consigo los cigotos?
Ovulación cíclica y corta (ratón, rata). Machos y hembras donadoras Hembras receptoras y machos vasectomizados Otras especies Tratamientos hormales en las hembras. Hembras donadoras y receptoras y machos.

45 Micromanipulador

46 Micromanipulador

47 Micromanipulador

48 Pronúcleo masculino

49 En animales domésticos (sobre todo en la
especie porcina) es necesario centrifugar el huevo debido al vitelo.

50 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

51 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

52 Agrobacterium tumefaciens con gen de interes DNA de la planta Co-cultivo 48 horas 22ºC Formación de callos Aislamiento de posibles plantas transformadas DNA insertado en el genoma Pruebas genéticas que permitan controlar la inserción del gen

53 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

54 LIPOSOMAS CATIÓNICOS pH SENSIBLE O ANIÓNICO
Su carga positiva reacciona con la negativa del DNA formando un complejo. pH SENSIBLE O ANIÓNICO Mediante una desestabilización por bajo pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”.

55 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS - Retrovirus - Liposomas - Elementos P INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

56 TRANSGÉNESIS DE DROSOPHILA MEDIADO POR ELEMENTOS P
La microinyección clásica no funciona. Dos plásmidos: Contiene el transgén. Contiene el trasposón con las secuencias repetidas que ayuda a la inserción (Elementos P)

57 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS - Retrovirus - Liposomas - Elementos P INDIRECTOS IN VITRO SÓLO EN CULTIVOS CELULARES

58 MÉTODOS “IN VITRO” (Cultivos celulares)
Las células modificadas genéticamente deberán ser introducidas posteriormente en el embrión u óvulo

59 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS - Retrovirus - Liposomas - Elementos P INDIRECTOS IN VITRO Precipitación con fosfato de calcio QUÍMICOS FÍSICOS

60 FOSFATO DE CALCIO Características: - Pequeña expresión del transgén.
Coprecipitación de DNA y calcio (presencia de fosfato). Introducción por endocitosis. Eficiencia de transfección 1% (max. 10%) Características: - Pequeña expresión del transgén. - Introducción de varias copias. - No hay toxicidad para las células.

61 IN VIVO IN VITRO - Espermatozoides - Biolística - Microinyección
DIRECTOS - Bacterias/Virus - Liposomas - Elementos P INDIRECTOS IN VITRO Precipitación con fosfato de calcio QUÍMICOS Electroporación FÍSICOS

62 ELECTROPORACIÓN - Mucha muerte celular Características:
Introducción del transgén por poros nucleares tras un choque eléctrico. Factores de eficacia: naturaleza, distancia entre electrodos, buffer y CÉLULAS. Características: - Mucha muerte celular - TENDENCIA A INTRODUCCIÓN DE UNA SOLA COPIA. ELECCIÓN.

63 ¿Cómo consigo un animal adulto a partir de células en cultivo?

64 DOS OPCIONES 1 2 Células indiferenciadas que sean capaces de colonizar
un embrión y formar parte de su organismo, incluidos los gametos. 1 DOS OPCIONES Células transformadas en indiferenciadas: CLONACIÓN 2

65 Células ES o indiferenciadas
SÓLO AISLADAS EN RATÓN

66 Método de agregación de mórulas-células
Color negro Color marrón Método de agregación de mórulas-células

67 Color negro Color marrón

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71 Knock-out Knock-in

72 Las células ES no se han aislado en otras especies animales
NUMEROSOS INTENTOS PERO...... Las células ES no se han aislado en otras especies animales (Experiencias realizadas en peces)

73 OTROS CULTIVOS CELULARES: Fibroblastos, Glándula mamaria, etc.
Clonación de células somáticas

74 DOLLY

75 DOLLY G0 : - Baja la transcripción. - Baja la traducción. - Condensación de la cromatina

76 PRODUCCIÓN DE: Millie, Christa, Alexis, Carrel y Dotcom
245 Polejaeva, I.A. y cols. (2000) Nature, 407, 86-90 5 72

77 Recombinación homóloga
Células “in vitro” Clonación

78 IN VIVO Al azar Microinyección Biolística (plantas) IN VITRO

79 MICROINYECCIÓN Ratón Conejo Porcino Ovino Bovino Eficacia
60% 50% 40% 40% 20% Animales Tiempo (meses) (Montoliu, 1999)

80 Recombinación homóloga
IN VIVO Al azar Microinyección Biolística (plantas) Recombinación homóloga IN VITRO Electroporación Células ES y clonación

81 Sabemos qué es... Sabemos cómo se hace... APLICACIONES

82 PRIMER RATÓN TRANSGÉNICO
Nature, 16, PALMITER y cols. (1982) Promotor Metalotionina I Gen de la Hormona del Crecimiento

83 Medline: “transgenic animals”
3.982 publicaciones ( )

84 - Funcionamiento promotores
1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal/Nuevos alimentos - Alimentos transgénicos Cambio cuantitativo Cambio cualitativo - “Biotecnología de corral” 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

85 - Funcionamiento promotores
1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal/Nuevos alimentos - Alimentos transgénicos Cambio cuantitativo Cambio cualitativo - “Biotecnología de corral” 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

86 1. Estudios en investigación básica.
REINO ANIMAL

87 1. Estudios en investigación básica. Funcionamiento de genes
- Muchos estudios realizados. - Más interesante la recombinación homóloga - Animal de elección es el ratón (menor coste en tiempo y en dinero) Ejemplo: Un animal Knock-out para una determinada enzima, que nos permita conocer la función de la misma. Un animal knock-in con marcadores para conocer la expresión durante la gestación.

88 Ejemplo: 1. Estudios en investigación básica.
Estudio de promotores, enhancer o cualquier elemento regulador. - Muchos estudios realizados. - Transgénicos clásicos fusionados a un marcador - Animal de elección es el ratón (menor coste en tiempo y en dinero) Ejemplo: Un transgénico con una zona del promotor de una enzima fusionado a la enzima b-galactosidasa

89 - Funcionamiento promotores
1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal/Nuevos alimentos - Alimentos transgénicos Cambio cuantitativo Cambio cualitativo - “Biotecnología de corral” 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

90 2. Producción Animal/Nuevos alimentos Modificaciones cuantitativas
- Muchos intentos realizados. - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación.

91 2. Producción Animal/Nuevos alimentos
REINO VEGETAL

92 LA REVOLUCIÓN AZUL!!!! Ejemplo (ya creado):
Un Salmón (Aqua Bounty Farms): - Promotor: AFP (proteína anticongelación) - cDNA: Hormona del crecimiento.

93 2. Producción Animal/Nuevos alimentos Modificaciones cualitativas
- Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. Reino vegetal: la mayoría de los alimentos. Reino animal: Proyectos de creación.

94 2. Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal Tolerancia a los herbicidas       54%  Resistencia a insectos (Bt)       37%  Resistencia vírica                 14%  Rasgos cualitativos               >1%  - Transgénicos clásicos. - Animales y plantas usados en alimentación. - Tomate Flavr-Savr. - Maíz Bt.

95 2. Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal Tomate Flavr-Savr: Primer producto transgénico comercializado en el mundo (Mayo de 1994). Maduración retardada. - Promotor: 35 S virus mosaico de coliflor. - RNA antisentido de la enzima poligalacturonasa (actuá sobre la pectina)

96 2. Producción Animal/Nuevos alimentos
Reino vegetal Maíz Bt:Muchisima presion social. Maíz que expresa la toxina del Bacillus thuringiensis se une a los receptores del tubo digestivo del insecto (taladro).

97 ¿Qué es un alimento transgénico?
Productos vegetales: tomate "Flavr Svr”, Maiz Bt... - Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin determinadas proteínas, etc. - Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias modificadas genéticamente (cuajo recombinante) - Animales tratados con proteínas recombinantes... - Animales alimentados con alimentos transgénicos

98 Biotecnología de corral
2. Producción Animal Biotecnología de corral - Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no existían células indiferenciadas en los animales que nos interesan. - Producción de proteínas de interés en sanidad. Ejemplo (ya creado): Tracy (Roslin Institute - PPL Therapeutics)

99 TRACY as1-antitripsina humana Promotor b-lactoglobulina ovina

100 Primeros ensayos en ratón:
4.3 Kb Promotor WAP de ratón 6.6 Kb de AAT-humano cDNA Obtienen microlitros de leche 12.5 gr./litro Volumen/año gr./año Producción vital 8 litros 400 litros l. 0.04 Kg. 2 kg. 50 kg 1 Kg. 100 kg. toneladas Coneja Oveja Vaca

101 Anticuerpos humanizados
Roslin Institute-PPL Therapeutics (lo que sabemos......) as1-antitripsina Fibrinógeno Factor VII y Proteína C Factor XI BSSL (lipasa) Anticuerpos humanizados

102 POLLY: Primer clon transgénico

103 Se obtuvieron 4 clones de fibroblastos embrionarios transfectados con:
b-lactoglobulina + Factor XI de coagulación POLLY MOLLY 2 no producían la proteína

104 - Funcionamiento promotores
1. Estudios en investigación básica - Funcionamiento de genes - Funcionamiento promotores 2. Producción Animal - Incremento de productividad Cuantitativo Cualitativo - “Biotecnología de corral” 3. Sanidad - Animales modelos de enfermedades - Xenotrasplantes - Terapia Génica Germinal.

105 Organismos modelos

106 C.elegans Organismo modelo para investigación de los mecanismos
moleculares de las enfermedades Transgénico para el péptido b amiloide o prenisilina, genes relacionados con Alzheimer. Yatin y cols. Neurobiol Aging May-Jun;20(3):325-30; Witerburg y cols.Nature Jul 20;406(6793):306-9.

107 D. Melanogaster GENES HOX DESARROLLO

108 D. Melanogaster Expresión del gen a-sinucleína (normal y mutantes)
Modelo de Parkinson. Feany y Bender. Nature 2000 Mar 23;404(6776):394-8 Sobreexpresión de Sim2 (homólogo al humano) Modelo de Sindrome de Down. Ema y cols. Hum Mol Genet 1999 Aug;8(8):

109 Primates 16/01/2001 lº Primate transgénico ANDI
Inyección en oocitos con retrovirus. Expresión de la GFP (Green Fluorescent protein). Producción de RNA mensajero.

110 Transgénico para lipoproteina a (Lpa). Modelo para arterioesclerosis.
Conejos Transgénico para lipoproteina a (Lpa). Modelo para arterioesclerosis. Rouy y cols, J Biol Chem 1998 Jan 9;273(2):1247-5

111 Ratón Especie de elección Metodología de creación puesta a punto.
Corto intervalo generacional Numerosos descendientes.

112 Ratón - Enfermedades genéticas: Knock-out o Knock-in.
- Otras enfermedades: transgénicos clásicos

113 ¿Cómo hago un modelo para una enfermedad cuya causa sea que una proteína no se exprese?

114 Knock-out HEMOFILIA TIPO B WANG y cols.  PNAS 94: , 1997.

115 ¿Cómo hago un modelo para una enfermedad cuya causa sea la sobreexpresión de una proteína?

116 DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE
Transgénico clásico DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Galbiati y cols. PNAS, Vol. 97, , 2000.

117 DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE

118 Knock-out HEMOFILIA TIPO B WANG y cols.  PNAS 94: , 1997.

119 ¿Cómo hago un modelo para una enfermedad cuya causa sea un número de copias de una region repetida superior a lo normal?

120 ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
Knock-in ENFERMEDAD DE HUNTINGTON Lin y cols. Hum Mol Genet 2001 Jan 15;10(2):137-44

121 ENFERMEDAD DE HUNTINGTON
Knock-in ENFERMEDAD DE HUNTINGTON Lin y cols. Hum Mol Genet 2001 Jan 15;10(2):137-44

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123 Mouse Models for Human Disease

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126 Mouse Models for Human Disease

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129 Combinación discordante que produce rechazo
3. Sanidad Xenotransplantes Candidata la especie porcina por... - Similitudes fisiógicas con humanos - Alta disponibilidad - Fácil cruzamiento. Problema: Combinación discordante que produce rechazo

130 Pruebas esperanzadoras transplantando el corazón a primates.
3. Sanidad Xenotransplantes Transgénicos porcinos con expresión de D.A.F (expresión en corazón): - Proteína que inhibe la cascada del complemento Pruebas esperanzadoras transplantando el corazón a primates.

131 TERAPIA GÉNICA GERMINAL
EN ANIMALES ? Transgénesis Enfermedades monogénicas candidatas.