Dolores Rodrigo, Antonio Martínez, Surama Zanini, Pablo Fernández.

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1 Dolores Rodrigo, Antonio Martínez, Surama Zanini, Pablo Fernández

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3 La seguridad microbiológica de los alimentos es un tema fundamental complejo de constante preocupación. Contribuyendo a esta complejidad y a la aparición de problemas de seguridad alimentaria están los cambios demográficos, origen geográfico de los alimentos, la producción y procesado de alimentos, los hábitos de consumo de alimentos y los microorganismos en sí mismos. Tanto los cambios el hospedador, el medio ambiente y el patógeno desafían nuestras políticas de seguridad alimentaria y nuestra capacidad para gestionar la seguridad alimentaria en todo el sistema alimentario.

4 Peligro: -Microbiológico -Químico -Físico Peligro: -Microbiológico -Químico -Físico Enfermedad Exposición Consumidor (Host) Consumidor (Host)

5 Enfermedad Peligro: -Microbiológico -Químico -Físico Peligro: -Microbiológico -Químico -Físico Exposición Consumidor (Host) Consumidor (Host)

6 Enfermedad Consumidor (Host) Consumidor (Host) Peligro: -Microbiológico -Químico -Físico Peligro: -Microbiológico -Químico -Físico Exposición

7 (a), microorganismos responsables de enfermedades transmisibles al hombre (zoonosis) (b), microorganismos responsables de enfermedades no transmisibles al hombre (c), microorganismos de contaminación exógena responsables de toxiinfecciones alimentarias (TIA), (d), microorganismos saprofitos, alterantes de los alimentos o involucrados en la producción de alimentos fermentados

8 Las enfermedades infecciosas cuya incidencia ha aumentado en las últimas 2 décadas o amenazan con aumentar en un futuro próximo Las nuevas infecciones resultantes de los cambios o evolución de los organismos existentes Infecciones conocida que se extiende a nuevas zonas geográfica o poblaciones Infecciones antiguas reemergentes como resultado de su aparición en nuevos vehículos Infecciones previamente no reconocidas Los organismos sobre los que hay que mantener un ojo vigilante

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11 Adaptación microbiana y cambio La susceptibilidad humana a la infección Clima y tiempo Cambio de los ecosistemas Demografía y el comportamiento Humanos Desarrollo económico y el uso de la tierra Los viajes internacionales y comercio La tecnología y la industria Reducción de medidas de salud pública La pobreza y desigualdad social Las guerras y la hambruna La falta de voluntad política Intención de hacer daño

12 Early times Heating Cooking food kills many foodborne pathogens 1770s-1800s Canning/Thermal Processing Significant discoveries in response to industrialization forces and Napoleon’s armies’ need for less dependence on local provisions 1890s Pasteurization Thermal treatment of raw milk to prevent milk from transmitting pathogens 1920s - 1930s Safe Canning/Processing Parameters Calculation of product heat penetration curve and initial microbial contamination level to determine minimum time-temperature combination for commercial sterility 1940s Freezing Mechanical quick-freezing methods to preserve while maintaining quality 1950s Controlled Atmosphere Packaging Reduced oxygen levels, increased concentrations of carbon dioxide, or selective mixtures of atmospheric gases to limit respiration and ethylene production, delay ripening and decay, and increase refrigerated product shelf life Table 1. Evolution of Food Processing (Goldblith, 1989; IFT, 2000a, 1989; Lund, 1989)

13 1960s Freeze Drying Rapid deep-freezing followed by sublimation of water by heating the frozen product in a vacuum chamber. Best known applied to coffee, to preserve delicate aroma compounds and maintain flavor and odor 1940s-1980s Aseptic Processing and Packaging High-temperature, short-time sterilization of food product independent of the container, container sterilization, and filling of product in sterile atmosphere, resulting in increased food quality and nutrient retention Irradiation Non-thermal process to kill pathogens, insects, and larvae, inhibit sprouting, and delay ripening and food spoilage 1990s Carcass Spray Treatments (e.g., water, acid), Steam Vacuuming, Steam Pasteurization Carcass decontamination interventions to meet microbiological performance criteria High Pressure Processing Foods subjected to specified pressures and temperatures to preserve food while maintaining quality Pulsed Electric Fields Foods subjected to specified Electric Fields and temperatures to preserve food while maintaining quality

14 Hasta 1950 los microorganismos patógenos conocidos transmisibles por alimentos eran Salmonella spp., Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens. Un poco mas tarde se sumo Bacillus cereus, Clostridium botulinum (cepas psicrofilas y psicrotrofas). El empleo masivo de la refrigeración en la cadena alimentaria y en los hogares permitió, en la decada de los 60, la identificación de Yersinia enterocolitica. La incorporación en la moderna industria alimentaria de metodologías de inactivación microbiana basadas en la utilización de diversos tipos de estrés y de tratamientos subletales, como en los alimentos mínimamente procesados han facilitado que la resistencia microbiana a un estrés confiera resistencia a otros (RESISTENCIA CRUZADA).

15 Un mayor consumo por las personas de hortalizas, frutas y zumos también ha propiciado un incremento en el numero de brotes de enfermedades transmitidas por alimentos. Los sistemas agrarios actuales de producción de alimentos y de ganadería intensiva también facilitan la prevalencia y auge de los microorganismos patógenos emergentes. La capacidad de algunos de estos microorganismos de formar películas biológicas (biofilms) les permite sobrevivir a numerosos procesos de conservación y eludir tratamientos de limpieza y desinfección.

16 En los procariotas, hay factores que determinan su tasa de evolución como las mutaciones puntuales, la recombinación genética, y la transferencia de material genético entre diferentes especies e incluso géneros bacterianos, Este ultimo proceso, conocido como de transferencia genética horizontal (TGH), constituye un proceso único de evolución bacteriana y ha conducido a cambios significativos en la composición de los genomas microbianos en periodos relativamente cortos de tiempo. Los genes bacterianos se transfieren entre diversos microorganismos por plasmidos, bacteriofagos, transposones conjugativos, simples transposones, integrones, y por islas genéticas. También se puede dar lo que se denomina resistencia cruzada, es decir la exposición a un estrés hace que la bacteria se haga mas resistente a otro estrés

17 Si una población de microorganismos se expone a una concentración o intensidad suficientemente elevada de un compuesto antimicrobiano o procedimiento físico de conservación, las células susceptibles morirán.

18 Sin embargo, algunas células pueden tener un mayor grado de resistencia natural o pueden adquirirlo más tarde a través de distintos tipos de mutaciones y podrán, por lo tanto, sobrevivir y crecer.

19 Estrés subletal de los microorganismos Modificaciones formulaciones de alimentos Reducción de las intensidades de las barreras/tratamientos de conservación de alimentos Modificaciones de las condiciones de procesado

20 Tratamiento conservación muertasmuertas viablesviables dañadasdañadasmodificacionesmodificaciones intactasintactas CONSECUENCIAS DE TRATAMIENTO SUBLETAL

21 Los estudios han demostrado que los patógenos dañados subletalmente pueden proliferar hasta niveles peligrosos cuando hay agua y nutrientes abundantes y lo que es peor se pueden convertir en un riesgo emergente debido a que pueden adquirir características nuevas o modificadas. Los estudios han demostrado que los patógenos dañados subletalmente pueden proliferar hasta niveles peligrosos cuando hay agua y nutrientes abundantes y lo que es peor se pueden convertir en un riesgo emergente debido a que pueden adquirir características nuevas o modificadas. El daño subletal es un aspecto importante que se debe considerar en la evaluación de la eficacia de cualquier método de conservación de alimentos debido a que la presencia de células bacterianas dañadas podría ser tan peligroso como la presencia de las que están totalmente intactas. El daño subletal es un aspecto importante que se debe considerar en la evaluación de la eficacia de cualquier método de conservación de alimentos debido a que la presencia de células bacterianas dañadas podría ser tan peligroso como la presencia de las que están totalmente intactas.

22 Caso del uso de los pulsos eléctricos de alta intensidad Caso del uso de antimicrobianos altas presiones

23  Tratamiento no térmico de conservación  Corriente eléctrica en forma de pulsos (1-100  s)  Campo eléctrico: E =10-40 kV/cm  Temperatura PEAI < Temperatura pasteurización V

24 Campo eléctrico Efecto de PEF sobre microorganismos Muerte microorganismo Irreversible Reversible Daño subletal Recuperación célula Alteraciones genéticas o proteicas Formación de poros Cambios en resistencia a tto, antibióticos, antimicrobianos. Cambios en virulencia, etc

25 En consecuencia, existe la posibilidad de la generación de modificaciones en las células como consecuencia del tratamiento

26 Estudiar la posibilidad de que mediante tratamientos subletales de PEF se produzcan modificaciones genéticas o proteicas en células de microorganismos OBJETIVO

27 CUANTIFICAR DAÑO EVALUACIÓN MODIFICACIONES PEAI E. colipUC19Resistencia ampicilina Generación transformantes PLAN EXPERIMENTAL E. coli DH5  Células tratadas Extracción proteínas Cuantificación proteínas Identificación proteínas CARACTERIZACIÓN INACTIVACIÓN CURVAS DE SUPERVIVENCIA CONOCIMIENTO TRATAMIENTOS 10-50% MUERTE Introducción material genético Modificación patrón proteínas

28 Curvas de supervivencia para E. coli DH5α a diferentes intensidades de campo (E), 15 kV/cm ( ♦ ), 20 kV/cm ( ▲ ) and 30 kV/cm ( ■ ).

29 Efecto de la temperatura de entrada en el porcentaje de supervivientes y porcentaje de células dañadas de E. coli DH5a tratadas por PEF

30 Efecto de la temperatura de entrada en el porcentaje de daño subletal y la frecuencia de transformación de células de E. coli DH5  tratadas por PEF

31 Imágenes de geles de electroforesis en 2-D del perfil de proteina de E. coli del control y tratado por el PEF (15 kV / cm, 700  s, 24 ° C) Modificaciones en el patrón de proteínas ControlTratada 15 kV/cm, 700  s a 7, 16, 24 y 38ºC 15 kV/cm, 700  s a 7, 16, 24 y 38ºC

32 Valores de los ratios de las proteínas de E. coli DH5a, con respecto al control, después del tratamiento por PEF

33 Valores de los ratios de las proteínas de E. coli DH5 , con respecto al control, después del tratamiento por (PEF) Spot no Protein Temperature (ºC) 7 16 24 38 1204 gmhA 4.42 2.38 8.17 5.19 3206 clpA 8.13 6.3 13.78 11.09 3321 ompA 0.13 0.03 0 0 5231 RS6 6.59 7.44 5.11 4.29 5237 RS6 8.01 7.52 5.16 3.24 6215 dut 5.68 4.94 6.35 6.17 8209 ftnA 4.42 6.48 6.39 6.96 OmpA: proteína situada en al parte externa de la membrana y actúa permitiendo la entrada de solutos OmpA: proteína situada en al parte externa de la membrana y actúa permitiendo la entrada de solutos El resto son proteínas relacionadas con la recuperación de funciones y estructuras celulares después del estrés El resto son proteínas relacionadas con la recuperación de funciones y estructuras celulares después del estrés

34 Los antimicrobianos naturales se están convirtiendo en productos muy populares en los procesos de conservación por barreras, ya que permiten el uso de tratamientos mínimos que no penalizan tanto las propiedades sensoriales y nutricionales de los alimentos. Los antimicrobianos naturales se están convirtiendo en productos muy populares en los procesos de conservación por barreras, ya que permiten el uso de tratamientos mínimos que no penalizan tanto las propiedades sensoriales y nutricionales de los alimentos. Dentro de los antimicrobianos naturales están entre otros el carvacrol y el citral (extractos oleosos de orégano y cítricos). Dentro de los antimicrobianos naturales están entre otros el carvacrol y el citral (extractos oleosos de orégano y cítricos). En el presente ejemplo se estudian los posibles cambios de virulencia en Listeria monocytogenes y Listeria innocua después de haber sido expuestas a concentraciones subletales de citral y carvacrol. En el presente ejemplo se estudian los posibles cambios de virulencia en Listeria monocytogenes y Listeria innocua después de haber sido expuestas a concentraciones subletales de citral y carvacrol.

35 Diseño experimental

36 Carvacrol Citral

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38 Caenhorabditis elegans o Nemátodo de 1 cm de longitud o Organismo modelo: o Es uno de los organismos animales más simples que cuentan con sistema nervioso y digestivo bien definidos o Es hermafrodita o Es transparente a lo largo de toda su vida o Es de muy fácil mantenimiento en el laboratorio, fácil de alimentar y manejar o Corta vida de 2-3 semanas lo convierte en un modelo de alto rendimiento con resultados en corto plazo de tiempo o Se alimenta preferentemente a partir de E. coli OP50

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41 Percentile % OP life span (days) LI-CA life span (days) LI-CI life span (days) LI life span (days) LM life span (days) LM-CI life span (days) LM-CA life span (days) 75 4.4±0.85.7±1.84.2±1.85.7±1.44.6±1.25.2±2.15.5±2.6 50 6.8±1,28.20±2,59.6±1,18.8±1,27.9±1,89.3±0,77.4±3,1 25 11.7±2,412.1±1,311.1±1,411.4±1,210.8±2,312.3±0,811.2±0,7 5 15.4±1,415.2±1,514.8±1,114.0±1,214.4±0,814.2±0,913.5±0,3

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43 2% y 4% de los gusanos alimentados en un césped de L. innocua tratados previamente con citral o carvacrol, respectivamente, 6% y el 10% de los gusanos alimentados con un césped de L. monocytogenes tratados previamente con citral o carvacrol, respectivamente 6% y el 10% de los gusanos alimentados con un césped de L. monocytogenes tratados previamente con citral o carvacrol, respectivamente

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45 Erythromycin0.51 0.501.50 Cephalothin0.190.251.122.00 Gentamicin0.51 1.001.50 Bacitracin0.13 1.00 Colistin0.04 1.00 Chloramphenicol1.00 0.501.50 Trimethoprim/Sulfamethoxazole 0.05 0.703.90 Ampicillin0.180.370.502.60 Ciprofloxacin0.38 0.102.80 First generationSecond generationFirst generationSecond generation AntibioticsListeria monocytogenesSalmonella enterica Table 3: Fractional inhibitory concentration for different antibiotics tested in presence of citral The MIC of the antibiotic in combination with the antimicrobial substance divided by the MIC of the antibiotic alone.

46 Erythromycin*0.016-256≤ 0.5≥ 80.125±0.0170.094±0.0170.064±0.009 Bacitracin**0.016-256≤ 1> 832.0±4.6184.0±0.1062.0±0.288 Colistin**0.016-256≤ 1> 896.0±18.47516.0±2.1053.0±0.577 Control group0.150 µL mL -1 of citral0.250 µL mL -1 of citral Erythromycin*0.016-256≤ 0.5≥ 80.125±0.017 0.064±0.009 Bacitracin**0.016-256≤ 1> 832.0±4.61824.0±4.6184.0±0.234 Colistin**0.016-256≤ 1> 896.0±18.47516.0±2.3094.0±0.387 Control group 0.100 µL mL -1 of carvacrol plus 0.150 µL mL -1 of citral 0.100 µL mL -1 of carvacrol plus 0.250 µL mL -1 of citral Erythromycin*0.016-256≤ 0.5≥ 80.125±0.0170.064±0.0090.016±0.002 Bacitracin**0.016-256≤ 1> 832.0±4.6182.0±0.2080.250±0.034 Colistin**0.016-256≤ 1> 896.0±18.4751.5±0.2880.75±0.144 Susceptibilit y breakpoints Resistance breakpoints Control group 0.100 µL mL -1 of carvacrol 0.175 µL mL -1 of carvacrol Antimicrobial agentConcentration (µg mL -1 ) MIC (µg mL -1 ) Interpretive criteria Minimum Inhibitory Concentration (µg mL -1 ) 1 Table 2 Antimicrobial susceptibility testing results of L. monocytogenes serovar 4b (CECT 4032) in the presence or absence of phytochemicals in complete culture medium (TSA-YE) by E-test ® method.

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48 Los microorganismos patógenos dañados subletalmente pueden convertirse en un riesgo emergente debido a que pueden adquirir características nuevas o modificadas.

49 Reducir, eliminar o controlar la presencia de BPEA no es facil si se consideran las posibles vias de contaminacion de los alimentos, los factores que influencian su supervivencia y la produccion de metabolitos toxicos, su ocultación intracelular su evasion del sistema inmune y su virulencia en personas sensibles Sin embargo, es necesario adoptar estrategias que aseguren la calidad y seguridad de los alimentos desde su produccion hasta su consumo.

50 La prevención y control de los microorganismos emergentes durante la producción primaria de alimentos de origen animal y vegetal La adopción por la industria alimentaria de sistemas de prevención y control de la calidad, un mejor manejo higiénico de los alimentos en los hogares y lugares de restauración colectiva. Un mayor control de los alimentos destinados a los sectores poblacionales mas sensibles. La aplicación de las tecnologías mas eficaces de inactivación microbiana, validadas, deberían ayudar, sin duda, a reducir la incidencia de enfermedades transmitidas por alimentos procedentes de microorganismos emergentes.

51 Annu. Rev. Nutr. 1997. 17:255–75 EMERGING ISSUES IN MICROBIOLOGICAL FOOD SAFETY J. Meng, M. P. Doyle Journal of Food Safety 18 (1998) 243-263. FACTORS AFFECTING THE EMERGENCE OF NEW PATHOGENS AND RESEARCH STRATEGIES LEADING TO THEIR CONTROL Arthur J. Miller, James L. Smith And Robert L. Buchanan Meat Science, Vol. 49, No. Suppl. I, Sl51-Sl67, 1998 FACTORS AFFECTING THE EMERGENCE OF PATHOGENS ON FOODS J. J. Sheridan and D. A. McDowell Foodborne Pathogens And Disease Volume 11, Number 4, 2014 INFLUENCE OF THE TREATMENT OF LISTERIA MONOCYTOGENES AND SALMONELLA ENTERICA SEROVAR TYPHIMURIUM WITH CITRAL ON THE EFFICACY OF VARIOUS ANTIBIOTICS Surama F. Zanini, Angela B. Silva-Angulo, Amauri Rosenthal, Dolores Rodrigo Aliaga and Antonio Martınez

52 Food Microbiology 50 (2015) 5-11 SUBLETHAL INJURY AND VIRULENCE CHANGES IN LISTERIA MONOCYTOGENES AND LISTERIA INNOCUA TREATED WITH ANTIMICROBIALS CARVACROL AND CITRAL A.Silva, S. Genoves, P. Martorell, S.F. Zanini, D. Rodrigo, A. Martinez Letters in Applied Microbiology 58, 486—492, 2014 EFFECT OF CITRAL AND CARVACROL ON THE SUSCEPTIBILITY OF LISTERIA MONOCYTOGENES AND LISTERIA INNOCUA TO ANTIBIOTICS S.F. Zanini1, A.B. Silva-Angulo, A. Rosenthal, D. Rodrigo and A. Martınez

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