Ameneiro, Cravero, Gonzalez, Ribuffo, Sosa.

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1 Receptores KDEL asisten la salida del virus del dengue del retículo endoplásmico
Ameneiro, Cravero, Gonzalez, Ribuffo, Sosa. Ameneiro, Cravero, Gonzalez, Ribuffo, Sosa

2 Introducción Dengue: infección viral transmitida por mosquitos, endémica en más de 100 países. Es causada por cuatro serotipos del virus del dengue (DENV 1-4)

3 DENV posee dos glicoproteínas estructurales:
pre-membrana (prM) envelope (E) La E media la interacción con receptores celulares,unión y entrada del virus, mientras que la prM asiste a E en su correcto plegado y la protege. El ensamblaje del virus ocurre en el RE y requiere la interaccion de prm y E.

4 Recientemente... Se identificaron dos factores celulares, Arf4 y Arf5 (ADP-ribosilation factor), implicados en la secreción de la progenie de DENV Cumplen un rol importante en el reclutamiento de proteínas necesarias para la formación de vesículas Deplecion de Arf4/5 también impide el transporte retrógrado de KDELR de Golgi al RE

5 Receptores KDEL (KDELR)
Receptores transmembrana en el RE, serían un factor clave del hospedador para la salida de la progenie del virus. El virus del dengue (DENV) interactuaría con KDELR y permitiría el transporte vesicular desde el RE hasta el aparato de Golgi.

6 Las tres isoformas identificadas del receptor KDEL son proteínas transmembrana, que ciclan entre el RE y Golgi previniendo la fuga de las proteínas residentes del RE (como las chaperonas) y las devuelven al mismo.

7 Mecanismo por el cual brotan los viriones

8 Algunas observaciones
La eliminación de arf4-5 inhibe el trafico retrogrado del receptor kdel de Golgi al RE. Bajo estas condiciones el virus se acumula en el RE y no llega al aparato de Golgi. La secreción de denv puede ser bloqueada por depleción del receptor kdel, arresto del ciclo de kdelr o interrumpcion de la unión denv-kdelr. El receptor kdel interactua con denv a través de 3 residuos cargados positivamente en el n terminal de prM. Los receptores 1 y 2 kdel juegan roles cruciales para denv 1-3 pero no en la secreción del 4.

9 Objetivo Evidenciar cual es el papel del receptor KDEL en el tráfico intracelular tanto DENV1 como de DENV1/RSP.

10 Métodos Se realizó RT-PCR para identificar a los KDELRs.
Para cuantificar la secreción de RSP, el área y la luminiscencia fueron medidos por densitometría usando Image Quant TL (Thermo Fisher).

11 Métodos RT-PCR Usada para comprobar que las celulas expresan KDELR y que el virus progenie sale de la celula

12 Métodos CO-INMUNOPRECIPITACIÓN
Estudio de la interacción proteína-proteína in vivo. Lisis de células que expresan ambas proteínas de interés Incubación con complejo Ab-proteína A unida a bead de agarosa Centrifugación y revelado del pellet por WB

13 Métodos Coinmunoprecipitación con:
Suero de paciente con dengue (contiene Ab anti prM y E) Suero de humano sano (no contiene Ab anti prM y E) Ab anti prM Ab anti E

14 Métodos Estudio in vitro de la interacción proteína-proteína GST PULL DOWN Expresión y purificación de la proteínas de fusión GST-prM truncada Lisis de células que expresan proteína tagueada cMyc-KDELR + Incubación de las proteínas con beads de agarosa-Glutatión, centrifugación y revelado del pellet por WB

15 Métodos FREEZE AND THAW (congelado y descongelado)
Para fraccionamiento subcelular Céls HeLa expresando prME-DENV1 wt mutantes (triple mutante y R6S) PBS+EDTA a 37°C por 5´ Lavadas 3 veces en hielo con PBS+EGTA Resuspendidas en buffer 8 ciclos freeze (hielo seco) y thaw (baño agua 37°C) Centrifugación a 4°C → núcleos y partículas celulares removidos sn: Centrifugación por 30´ a velocidad máxima a 4°C → pellet: fracción membrana sn final: RSP → WB Para excluir la posibilidad de que la ruptura de la interacción prM/KDELR comprometa el ensamblaje y la formación de partículas virales

16 Métodos MICROSCOPÍA DE INMUNOFLUORESCENCIA da para una imagen?SIIII
Técnica de inmunomarcación que hace uso de anticuerpos unidos químicamente a una sustancia fluorescente para demostrar la presencia de una determinada molécula. Se diferencia de otras técnicas inmunoquímicas en que aquí la marca unida al anticuerpo es una molécula fluorescente tal como por ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína. Luego se expone la muestra así tratada a una fuente de luz de onda corta (ultravioleta o azul). Esta luz de onda corta genera un fenómeno de fluorescencia en la molécula marcadora que a su vez emite luz a una longitud de onda más larga (verde, amarillo o naranja). da para una imagen?SIIII

17 Métodos MICROSCOPÍA DE INMUNOFLUORESCENCIA Ab Anti prME
marcadores de cis Golgi (anti GM130) y RE b Para estudiar la distribución de KDELR en céls transfectadas con prME (HeLaprME-DENV1) Para estudiar el rol de la interacción prM/KDELR en el tráfico de RSP dentro del RE Céls expresando prME wt prME triple mutante prME R6S A Anti E (4G2) marcadores de RE (anti calnexina), cis Golgi (anti GM130), trans Golgi (anti TGN46) Para investigar si la interacción con KDELR era requerida para la salida de DENV1 del RE (translocación de RSP al cis Golgi se determinó como prot E colocalizada con GM130) Para extraer y cuantificar células teñidas con la proteína E del virus, se desarrolló un protocolo específico, '' células teñidas, '' en el software ICY . Para extraer y cuantificar células que contenían los agregados de RSP se realizó un protocolo separado,en el software ICY

18 Resultados

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26 céls HeLa expresando KDELR-RFP transfectadas con siRNA Arf 4+5 teñidas con Ac anti GM130
céls HeLa-prME-DENV1 transfectadas con siRNA Arf 4+5 coIP WB

27 céls 293T transfectadas con construcciones prME-DENV1 con aa neutros; coIP; WB- densitometría

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32 Discusión KDELR1 y KDELR2 desempeñan papeles cruciales para DENV1-3, pero no influyen en la secreción de DENV4. KDELRs funcionan como receptores luminales para el transporte de DENV a lo largo de la vía secretora. → El proceso de transporte de DENV del RE al Golgi tiene similitudes con la entrada viral. En ambos procesos se trasloca de un ambiente neutro (RE) a un compartimiento acido (Golgi) y se necesita atravesar la barrera de la membrana lipídica para su destino final: citoplasma para replicación o extracelular para nueva infección.

33 Discusión En el virus inmaduro prM se apoya
por encima de la proteína E para protegerla del ambiente acido a lo largo de la via secretoria. Esta topología hace a prM mas accesible para interactuar con las proteínas del hospedador. El pH acido de Golgi puede facilitar la disociación de los complejos PRM/KDELR mediante reducción de la afinidad.

34 Discusión La liberación de DENV4 se inhibe por knock down de ARF4-5. Esto puede resultar en el secuestro de KDELR en Golgi, lo que reduce su disponibilidad para el trafico de DENV4. DENV4 puede interactuar en el RE con receptores intracelulares adicionales y ser capaz de traslocarse por vía secretoria inclusive cuando los KDELRs son regulados negativamente.

35 Discusión La unión a ARF4-5 y KDELR en el RE son eventos independientes. ARF4-5 se localizan tanto en Golgi como en RE y tienen dos roles cruciales en la secreción de DENV: el reciclaje de KDELR (en Golgi) la interacción con la proteína prM(en RE) Los KDELRs reconocen chaperonas que son llevadas por vesículas del RE al Golgi. Se especula que durante la biogénesis de DENV1-3 los viriones nuevos formados se unen a los KDELR no ocupados para activar las vías de señalización que facilitan su translocación al Golgi.

36 En resumen… KDELR interactúa con la glicoproteina prM, en el dominio amino terminal El knockdown de KDELR reduce la secrecion de DENV RSP El knockdown de KDELR reduce el egreso de DENV KDELR/ prM interactuan en el ER Los residuos H2,R19 y K21 son claves para la interaccion KDELR/ prM La interacción KDELR/ prM afecta la formacion de vesiculas de RSP.