Equipo Dr Salamone Daniel Dr Gibbons Alejandro Dra Cueto Marcela Dr Rafael Fernández y Martín Dr Pereyra Bonnet Federico Laboratorio de Biotecnología Animal-Facultad.

Presentación del tema: "Equipo Dr Salamone Daniel Dr Gibbons Alejandro Dra Cueto Marcela Dr Rafael Fernández y Martín Dr Pereyra Bonnet Federico Laboratorio de Biotecnología Animal-Facultad."— Transcripción de la presentación:

1 Equipo Dr Salamone Daniel Dr Gibbons Alejandro Dra Cueto Marcela Dr Rafael Fernández y Martín Dr Pereyra Bonnet Federico Laboratorio de Biotecnología Animal-Facultad de Agronomía Universidad de Buenos Aires, Argentina Laboratorio de Rumiantes Menores-UE Bariloche Instituto Nacional de tecnología Agropecuaria ANIMALES TRANSGENICOS

2 Como fabricar una proteína humana? Por ejemplo: la insulina se usa para tratar la diabetes. Como podemos producir toda la insulina que se necesita para tratar a 400 millones de pacientes en el mundo?

3 Con una BACTERIA

4 PRODUCCIÓN DE UNA PROTEÍNA

5 Plásmido (vector de ADN) Plásmido pCX-EGFP Animales Transgénicos

6 Otros sistemas Plantas transgénicas Animales transgénicos Animales Transgénicos

7 ADN humano Gen de la Insulina “Vacas que expresan insulina en la leche” (25 vacas para demanda mundial) Ovulo de vaca Introducción

8 Como? Promotor de las glándulas mamarias Gen de la Insulina Direccionamos la expresión!!! Animales Transgénicos

9 Recolección de los ovocitos Obtención de ovocitos a partir de animales sacrificados para consumo - Progreso genético mínimo - Garantía sanitaria escasa - Uso en Investigación Aspiración de los folículos antrales Complejos cúmulus-ovocitoLavado de ovarios

10 Cultivo in vitro = Animales Transgénicos

11 Microagujas Equipo de laboratorio Animales Transgénicos

12 Transgénicos por microinyección de pronúcleos Gordon et al., 1980 (PNAS)

13 Transgénesis por microinyección de pronúcleos Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Gordon y col., 1980 (PNAS) (-) -Mosaicismo -Baja eficiencia (0,003 % Bovino) -Inserción del transgén al azar (+) -Ampliamente usada

14 Introducción Wilmut et al., 1997 Nature 385,810–813. Clonación oveja Dolly

15 75 Day Fetus Tissue culture Fetal cells FIBROBLAST oocyte EXTRACCION DE NUCLEO Enucleated oocyte FUSIÓN CELULAR OVULO ACTIVADO CON NUCLEO DE FIBROBLASTO 7 Days embryo Recipient cow Embryo transfer 278 days Cloned calf

16 PASOS DE LA CLONACIÓN ENUCLEACIÓN Fotos Cyagra

17 PASOS DE LA CLONACIÓN TRANSFERENCIA NUCLEAR Fotos Cyagra

18 Transgénesis por clonación (SCNT ) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Cibelli y col., 1998 (Science) (+) -Ampliamente usada -Identificar integración del transgén in vitro (-) -Impronta -Eficiencia 1-3% -Inserción del transgén al azar -Consumo de tiempo

19 TRANSGENESIS MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES Además del ADN paterno (función natural), el espermatozoide lleva ADN exógeno

20 Ovocito Gen exógeno Espermatozoide espermatozoide llevando el gen exógeno al interior del ovocito ESQUEMA DE LA TECNICA Animales Transgénicos

21 Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Coincubación Plásmidos Espermatozoides Incubación espermatozoides/plásmidos

22 ICSI Pipeta de holding 1er. CP Espermatozoide Transgénesis por Espermatozoides

23 ICSI Lugar de deposición Transgénesis por Espermatozoides

24 ICSI Sin espermatozoide Transgénesis por Espermatozoides

25 Transgénesis mediada por espermatozoides Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA (+) -Sencilla -Alta eficiencia (-) -No ha sido usada en rumiantes -Inserción del transgén al azar -Mosaicismo en embriones Brinster y col., 1981 (PNAS)

26 Microscopía confocal Plásmido marcado color verde (FITC) Núcleo espermático color rojo (IP) Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA (1000x)

27 Microscopía confocal de ovocito inyectado Espermatozoide con ADN exógeno Núcleo ovocito Ovocito Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA (400x) qPCR Copias del plásmido 3x10 5 moléculas por espermatozoide.

28

29 91% GFP tratamiento corto y 66% GFP tratamiento largo.

30 Caballos 29% Gatos 26% (Med Vet J. Jarazo) Vacas 23% Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Cerdos 60% (R. Olivera) Mosaicismo20-60%

31 Modificación Modificación genética a realizar Cutícula (cutina) Hongo fitopatógeno Fusarium solani CUTINASA Sintetizar el gen de la cutinasa con un promotor de glándulas salivales Transferirlo a una Oveja para que exprese cutinasa en saliva y aproveche mejor la oferta forrajera

32 Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Esperanza 1 (25/04/08) Esperanza 2 (04/08/09) Dinastía ESPERANZA Negativos para el transgén por PCR y Southern blot. Confirmación de paternidad por microsatélites.

33 Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA

34 Papers y Reconocimientos Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA 2009 Medalla de Oro OMPI SBTE 2007 INNOVAR 2008

35 Leche humanizada de vaca INTA Balcarce y Univ. de San Martín RositaIsa Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA Ganadería Bovinos resistentes a la “vaca loca” Richt y col., 2006.

36 Transgénicos por Clonación

37 Medicamento producido por animales transgénicos autorizado por la FDA. Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA GTC Biotherapeutics, Massachusetts.

38 Ratones: Modelos de Enfermedades o para Investigaciones Laboratorio de Biotecnología Animal, FA-UBA

39 Producción de órganos para xenotransplante: - Producción cerdos que expresan proteínas humanas que bloquean la acción del complemento (ej. CD59). - Transplantes de corazón o hígado en forma temporaria hasta la obtención de donante compatible.

40 1796 Edward Jenner, descubre de la “vacuna” antivariólica. Viruela: Causante en el Siglo XVIII de 60 millones de muertes Siglo XX: En Mayo de 1980, la OMS declara oficialmente la erradicación mundial de la viruela humana Pasado Las Vacunas: Primer ejemplo de la utilidad de los animales de granja en la salud humana. Animales Transgénicos

41 Presente Fermentador como bioreactor para producir vacunas y proteínas recombinantes para la salud humana Animales Transgénicos

42 En el siglo XVIII y en oposición a la tecnología de Jenner, se dijo: “Existen informes fidedignos de niños que habían empezado a mugir y andar en cuatro patas y de gente con cuernos” por haber sido vacunados. La realidad demostró lo contrario, ¿hoy en el Siglo XXI, escuchamos comentarios similares? Siempre se escuchan las voces de los detractores del desarrollo científico Animales Transgénicos Futuro