Técnicas en Biología Molecular (Techniques in Molecular Biology) Profesor: Washington B. Cárdenas Horario: Miercoles 11h30 a 13h30 Jueves 8h30 a 10h30.

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1 Técnicas en Biología Molecular (Techniques in Molecular Biology) Profesor: Washington B. Cárdenas Horario: Miercoles 11h30 a 13h30 Jueves 8h30 a 10h30 10-29-08

2 Cloning scheme for Ebola VP35 1.Identify gene to clone in gene bank (AF086833) 2.Create a restriction map of the gene. http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/index.html 3.Use online translation tools to identify deletion mutant boundaries. http://www.expasy.org/http://www.expasy.org/ 4.Identify nucleotides to design pertinent primers with adequate restriction sites 5.PCR to clone selected fragments into an expression vector

3 C-122 C-185 N-222 VP35 C-253 N-160 N-91 1 218 155 87 91 1 1 160 222 1 135 87222 340 VP35 deletion mutant sequences in AA Use www.expasy.org web site to predict the mol wt (daltons) of the different constructs.www.expasy.org 10-23-08

4 1.Liste por lo menos 10 enzimas de restriccion con sticky ends complementarios 2.Indique qué tipo de overhangs dejan estas enzimas Deber para Miercoles 29 de Octubre

5 10-30-08 Técnicas de amplificación del material genético 1.PCR Amplificación de un a sección de ADN de cadena doble, delimitada por un par de primers o iniciadores que inician la síntesis de ADN en sentidos opuestos. 1.RT-PCR Amplificación de una sección de ADN después de un proceso inicial de síntesis de cADN, a aprtir de una cadena sencilla de ARN. a)One step RT-PCR La síntesis de cADN y amplificación por PCR se realiza en la misma reacción. Se requieren de 3 primers o iniciadores a)Two steps RT-PCR La síntesis de cADN se realiza físicamente separada de la reacción de PCR. Un volumen determinado (ul) del RT se utiliza como fuente de AND para la segunda reacción de PCR.

6 Enzimas utilizadas en la amplificación del material genético EnzimaOrganismoTemperatura Optima ( o C) Actividad exonucleasa Error x10 -6 Estabilidad TaqThermus aquaticus 75-805’-3’20-1009 min a 97.5 o C PfuPyrococcus furiosus 72-783’-5’1.6240 min a 95 o C 1.PCR Termoestable ADN polimerasa-dependiente de ADN 2.RT ADN polimerasa-dependiente de ARN. Las RT se utilizan principalmente para transcribir ARNm en cADN. La reacción se puede “primar” con Oligo(dT) 12-18 o con oligos de secuencia definida. Son enzimas que provienen de retrovirus: a)Avian myeloblastosis virus (AMV).-Tiene actividad de polimerasa y una potente actividad de RNase H. Esta enzima trabaja con efectividad a 42 o C y a pH 8.3. b)Moloney murine leukemia virus (Mo-MLV).-Tiene actividad polimerasa y una débil actividad RNase H. Trabaja efectivamente a < 42 o C y a pH 7.6.

7 Tarea para Miercoles 5 Nov Diseñar primers para clonar VP35 completo y sus mutantes en el vector de expresion pcDNA3.1+(invitrogen) 11-05-08

8 Ventajas Des-ventajas One step RT-PCR Two steps RT-PCR

9 Klenow Fragment Es el fragmento grande de la ADN polimerasa I de E. coli. Tiene dos reacciones importantes que modifican las secuencias terminales dejadas por las enzimas de restricción: a)Llena las extensiones 5’.-Actividad 5’-3’ ADN polimerasa. b)Elimina las extensiones 3’.-Actividad 3’-5’ exonucleasa. ARN polimerasas-dependientes de ADN Enzimas producidas por bacteriofagos SP6, T7 o T3. Realizan la síntesis de ARN a partir de un temple de ADN de cadena doble.

10 TAATACGACTCACTATAG ATTATGCTGAGTGATATCCCTCTACGCA… +1 ATTATGCTGAGTGATATCGGAGATGCGT… Sense Transcripción por las polimerasas T7, T3, o SP6 no requiere que todo el ADN sea de cadena doble TAATACGACTCACTATAG +1 Anti-sense

11 Síntesis direccional de una librería de genes expresados

12 C-122 C-185 N-222 VP35 C-253 N-160 N-91 1 218 155 87 91 1 1 160 222 1 135 87222 340 Expected molecular weight (kDa) of VP35 deletion mutants 11-05-08

13 1.Cómo se preparar � ía 10 ml de la solución de trabajo indicada, utilizando componentes de soluciones stocks. Soluciones stocks:Solución de trabajo: 0.5M EDTA1 mM EDTA 1.0M TRIS100 mM TRIS 0.5M EGTA5 mM EGTA 10% SDS1% SDS 2.Prepare 100 ml de una solución stock 50X con los siguientes reactivos ComponentesConcentración 50XPeso g - Glycine MW 76.50 g/Mol1.5 M - NaCl MW 58.440.75 M - Tris MW 124.140.25 M