Ciclo Celular El ciclo celular es una serie ordenada de eventos macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la producción de dos células,

Presentación del tema: "Ciclo Celular El ciclo celular es una serie ordenada de eventos macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la producción de dos células,"— Transcripción de la presentación:

1 Ciclo Celular El ciclo celular es una serie ordenada de eventos macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la producción de dos células, cada una conteniendo un número idéntico de cromosomas a la célula madre. Objetivos de charla: Presentar como la unión de varios estudios independientes generó el conocimiento base sobre el ciclo celular. Presentar diferentes técnicas moleculares utilizadas para la disección de los mecanismos de control de un proceso fisiológico, en este caso el ciclo celular. Presentar conocimiento actual la regulación del ciclo celular en plantas. Relación entre división celular y desarrollo. Transducción de señales de los principales reguladores de crecimiento INTRODUCCIÓN Qué saben del ciclo celular? Teoría Celular, 1838, Theodor Schleiden y Jacob Schwan: todos los organismos están compuestos de células Toda célula se origina a partir de otra célula ASLKF

2 El ciclo celular es una serie ordenada de eventos macromoleculares que lleva hasta la división celular y a la producción de dos células, cada una conteniendo un número idéntico de cromosomas a la célula madre.

3 Objetivos Mostrar como la unión de varios estudios independientes generó el conocimiento base sobre el ciclo celular. Presentar diferentes técnicas moleculares utilizadas para la disección de los mecanismos de control de un proceso fisiológico, en este caso el ciclo celular. Mostrar el conocimiento actual la regulación del ciclo celular en plantas. Transducción de señales de los principales reguladores de crecimiento

4 Introducción Teoría Celular, 1838, Schleiden y Schwan
Todos los organismos están compuestos de células Toda célula se origina a partir de otra célula ¿Cómo originar célula nueva? Información de cómo realizarlo Capacidad de síntesis de todos los componentes (duplicar todo) Mecanismo de control del proceso Avance Asegure la fidelidad del proceso Estudios sobre la división celular Teoría Celular, 1838 Theodor Schleiden y Jacob Schwan: todos los organismos están compuestos de células Toda célula se origina a partir de otra célula ASLKF

5 Descripción de eventos del ciclo celular:
1. evento cíclico en: aumento de masa continuo, duplicación del DNA en etapa específica, división celular, segregación de cromosomas 2. evento ordenado, siempre misma secuencia

6 Estudios relacionados con el ciclo celular:
Interfase: crecimiento y duplicación del ADN Profase: condensan cromosomas y se rompe membrana nuclear Prometafase: centros de formación de ut se forman Metafase: cromosomas en plano central y unidos a utOC Anafase: cromosomas migran e inicia citokinesis Telofase: migración de cromosomas a los polos Citokinesis: termina citokinesis Interfase Estudios en los 70´s % células en

7 G1 12 horas S 6 horas G2 6 horas M 0.5 horas
En los vertebrados adultos el ciclo celular más rápido dura alrededor de 1 día.

8 Estudios relacionados con el ciclo celular: Contenido de DNA de grupo de células
Se comparan diferentes tejidos de la misma planta o Se compara el mismo tejido en diferentes plantas Lo que se obtienen son patrones. Entonces se dice que X % de las células se diferencia en G2 o en G1.

9 Estudios de comparación de ciclo celuar en diferentes organismos: células somáticas de humanos
Y células embrionarias de un huevo fertilizado. Las primeras son más lentas, la hija debe alcanzar el tamaño de la madre antes de dividirse. En el caso de los huevos luego de la ferilización las divisiones se dan sin crecimiento de las hijas, por eso cada vez las células son más pequeñas. Las divisiones iniciales en los embriones son SINCRONIZADAS.

10 Experimentos de Fusión de células de Mamíferos:
Orden de etapas Núcleo emite instrucciones M: induce a G1, S, G2 a avanzar en orden (ALTERNAMIENTO) Etapas deben finalizar antes de iniciar otras (TERMINACIÓN) S induce G1 a duplicar ADNl S no induce a G2 a replicar Block a re-duplicación Rae, P. N., & Johnson, 1970 Johnson and Rae, 1970

11 Análisis bioquímico del ciclo celular (estudio en células embrionarias)
Xenopus laevis Células grandes 1mm Posible obtener en gran número, 1 hembra produce miles Gran número en espacio reducido Gran número en corto tiempo Divisiones iniciales son sincronizadas

12 Ciclo de vida de Xenopus laevis

13 Células del Folículo Detiene en Metafase II

14 (FACTOR DE PROMOCIÓN DE LA MITOSIS/MADURACIÓN)
DESCUBRIMIENTO DEL MPF (FACTOR DE PROMOCIÓN DE LA MITOSIS/MADURACIÓN) Oocitos se inducen a madurar con progesterona y entran en MEIOSIS. Si se toma 5% de su citoplasma se logra inducir a oocitos inmaduros a madurar. Esto se puede seguir repitiendo y plt diluyendo al progesterona inicial y siempre respuesta. Plt no es la progesterona sino algo que esta indujo al principio y luego este se induce y multiplica. A esta actividad se le denominó: Factor de inducción de la maduración Este resultado aunque muy importante no se le dio gran apoyo porque era en células meióticas y se creía que era específico para meiosis y no mitosis. Ojo estímulo es citoplasmático porque oocitos sin núcleo igual transmiten efecto. Masui, Y., & Markert, C. L., 1971.

15 Medición de MPF en proceso de oocito a blástula
Esta actividad fue luego medida en el proceso de producción de la blástula a partir del oocity inmaduro. Se utilizó el sistema de oocitos inmaduros y se observó que la actividad de la MPF fluctuaba entre cada división celular. Luego de la fertilización, al salir de Metafase II se reduce la actividad que vuelve a aumentar al entra en M y luego vuelve a caer. Gerhart, ., Wu, M., & Kirschner, M.J. ,1984

16 MPF también induce mitosis
A partir de un oocito fertilizado se inician los ciclos de mitosis hasta formar la blástula Si se inhibe la síntesis de proteínas (cicloheximida) no se inicia mitosis, pero si se inyecta MPF si se da. Esto implica que MPF puede inducir mitosis. La actividad de MPF depende de la síntesis proteica. XLT: MPF también denominado Factor Promotor de la Mitosis

17 Actividad MPF independiente de ensamblaje del huso (nodoconazole)
síntesis de DNA (afidicolina) Xlt: independiente del estado del núcleo!??? Motor del ciclo celula todas las reacciones que inducen la activación o inactiviación de MPF Eventos secundarios Eventos inducidos por la act. o inactiv. de MPF Indenpendecia del núcleo es una característica del los huevos de Xenopus, en los cuales se da una independencia del MPF del estado del núcleo, pero como veremos más adelante esto no es la generalidad, sin embargo este resultado es usado para dividir en dos tipos de eventos el control del cc: el motor y los eventos secundarios. Lo que ocurre es que MPF se sintetiza en el citoplasma y cuando alcanza es activado este rompe la membrana nuclear y condensa los cromosomas, este mismo MPF origina su degradación, se decondensan los cromosomas, se forma la membrana nuclear y se vuelve a inicir la síntesis de MPF afuera del núcleo.

18 Eventos secundarios Alta MPF Motor del CC Baja MPF Eventos secundarios

19 Pico de MPF y detención del ciclo celular en Xenopus se da en Metafase del CC. Al caer actividad cc avanza a Anafase.

20 Descubrimiento de la CICLINA
Cuál es la causa de la oscilación del MPF. Se buscó mucho una proteína que mostrara un patrón de acumulación cíclico, porque se sabía que se requería de síntesis proteica para activar el MPF, sin embargo fue muy difícil localizar estas proteínas, en particular porque aumento era en muy poca cantidad y existía poca sensibilidad de las técnicas. Se marcó radiactivamente un aa y se le suplió a las células, luego se muestreó cada 10 min para observar si alguna proteína mostraba el patrón esperado. La mayoría de las proteínas aumentaban en el tiempo, pero se encontró una que aumentaba con el tiempo a partir de interfase y luego desaparecía abruptamente al final de mitosis. A esta proteína se le llamó CICLINA y se propuso el siguiente modelo. Evans, T., Rosenthal, E. T., Youngblom, J.. Distel, D.. & Hunt, T.1983

21 Se propuso que la ciclina era degradada por el MPF y esto permitía la salida de Mitosis al inactivar el MPF. Luego se iniciaba de nuevo al acumulación de ciclina hasta activar el MPF:

22 Evidencias de estudios bioquímicos
Ambos ensayos (exp. de inyección y de fusión) prueban que las células mitóticas tiene un factor inductor dominante Oocitos, MPF oscila aún si DNA no está replicado, no en exp. de fusión Se creyó que ambos sistemas poseían regulación diferente. Sistema de inyección en oocytos (maduración) permitió tener un sistema para purificar MPF pero: MPF difícil de purificar Experimento era difícil de realizar Se creía que control de meiosis era diferente de mitosis

23 Análisis genético del ciclo celular (estudio en levaduras)
Dos tipos de levaduras Saccharomyces cerevisiae (pan, vino, cerveza) levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura de gemación Ventajas Rápido crecimiento (división cada 90 min) Medio de crecimiento sencillo Genoma pequeño Fácil de detectar etapas del ciclo celular (tamaño de gema) Inicio de gemación coincide con paso por INICIO (START) Unicelulares Sistema ampliamente estudiado desde 1960’s

24 Diferencias con células embrionarias
Se detectan dos Puntos de Control Entrada a S, regula tamaño de célula Entrada a M, chequea duplicación del ADN Mitosis es cerrada (no se rompe memb. Nucl. Ensamblaje de huso inicia antes de finalizar duplicación de DNA Difícil detectar el ingreso M Tamaño de gema indica etapa del CC INICIO Células crecen hasta alcanzar tamaño de célula madre, alargan G1 y retrazan paso por INICIO, si no hay nutrientes no avanza (diferente a embriónicas en que nutrientes no faltan) ENTRADA A M Si se daña o retraza duplicación del ADN se retraza ingreso a M

25 Budding yeast Schizosaccharomyces pombe (cerveza pombe) levadura de gemación Budding yeast

26 Identificación de mutantes del CC
Budding yeast Identificación de mutantes del CC Identificación de mutantes sensibles a la temperatura. Estos son mutantes condicionales, crecen ok a 25 C pero si se aumenta la temperatura ya no crecen. Un mutante no condicional no permitiría ver la población al no poder dividirse y crecer. Si son mutantes de una reacción importante del CC deben deterner todas las células en un punto específico del ciclo celular. Cómo se identifican los mutantes. Estos son suspensiones de levaduras que se platean y se ponen a crecer a una temperatura normal (25 C), luego plato es transferido a 37 C y se observa crecimiento de colonias. Las que no crecen son mutantes. Se observan al microscopio y las que se detienen en un punto específico del CC son mutaciones relacionadas con el CC, las que no desarrollan algún evento del CC son también relacionadas con el CC. 32 mutantes cdc “cell division cycle”

27 Mapa de Mutantes Budding yeastv
Cdc28: detiene antes de S Cdc24: inhibe gemación pero pueden continuar síntesis de DNA y duplicación de MTOC Cdc7: inhibe síntesis pero permite MTOC y gemación Cdc31: inhibe MTOC pero permite DNA sintesis y gemación Cdc20: inhibe mitosis pero permite gemación Cdc/3: inhibe mitosis Hartwell, L. It, Culotti. J., P J. R., & Reid, 1974

28 Budding yeast Proteína esencial para el avance del CC No permite ingreso a S, este punto del cc se define como INICIO (START), no permite ningún evento secundario Luego de este punto la célula esta comprometida a completar el CC La célula coordina crecimiento y motor del cc La célula evalúa estado nutricional, si es pobre detiene CC (diferente a embriones)

29 Quién es cdc28? Tendrá alguna relación con MPF?

30 Saccharomyces cerevisiae (levadura común)
Fission yeast Antes de averiguar quién es cdc28, habían trabajos paralelos en la otra levadura. Esta levadura como sistema de estudio presentaba caracterísitcas muy similares a budding yeast: Rápido crecimiento (división cada 90 min) Medio de crecimiento sencillo Genoma pequeño Fácil de detectar etapas del ciclo celular Unicelulares Sistema ampliamente estudiado desde 1960’s Saccharomyces cerevisiae (levadura común) Levadura de fisión (método de división) Fission yeast

31 Regulación del tamaño División ocurre siempre a un tamaño dado
Longitud del ciclo celular es mayor en células hija que en células madre (By). Falta de nutrientes detiene CC en INICIO By y en ENTRADA A MITOSIS en Fy Lo anterior refleja una evaluación del ambiente externo para permitir la continuación del CC INICIO y ENTRADA A MITOSIS: dos puntos de control del CC. Ambos existen en ambas levaduras, pero uno se detecta más facilmente en una y el otro en la otra. En By se observa INICIO y en Fy se observa ENTRADA A MITOSIS. En By las células tardan más en alcanzar su tamaño para iniciar división y en Fy las células ya tienen su tamaño al momento de la división entoces pasan directo por INICIO, el paso limitante el la duplicación del ADN en S, entonces se detienen en ENTRADA A MITOSIS, hasta que todas hayan cumplido S.

32 Enzimas que controlan CC
2 modelos: Xenopus, motor del CC sin control, embriog. Levaduras, alto regulación del CC, somática Mutantes: wee1 cdc 25

33 Wee1+ wee1- (ts): Mutante de Fy células se dividen a un tamaño menor
Posible inhibidor de avance del CC hasta alcanzar tamaño adecuado, al mutarse pierde su actividad como inhibidor Actividad en INICIO o en ENTRADA A MITOSIS Al aumentar temperatura se da explosión de M no de S, se elimina control de tamaño para M, ahora punto de control es en INICIO

34 Fission yeast Se reflejan 2 puntos de Control: ENTRADA A MITOSIS
INICIO Comportamiento de mutante wee1-: Al eliminarse el control de tamaño en ENTRADA A MITOSIS las células son más pequeñas al llegar a S. Ahora retrazo ocurre en este punto y deben alcanzar un tamaño adecuado antes de continuar. Se reflejan plt 2 puntos de control

35 cdc25+ cdc25 (ts): Mutante de Fy
Fission yeast cdc25+ cdc25 (ts): Mutante de Fy Detienen ciclo antes de M pero continuan creciendo Mutación puede ser rescatada por wee1-

36 cdc2+ cdc2 (ts): Mutante de Fy
Fission yeast cdc2+ cdc2 (ts): Mutante de Fy Detienen ciclo antes de M pero continuan creciendo Mutación no puede ser rescatada por ninguna otra mutación

37 Detiene en G2 Mutación dominante cdc13 mismo fenotipo que cdc2 ts
Cdc2 no rescatable por otras mutaciones, implica su rol es esecial para ENTRADA A MITOSIS Cdc25 y wee1 rescatables entre si, posiblemente interactuan, ambos regulan tamaño cdc mismo fenotipo que cdc2 ts

38 Russell, P., & Nurse, P. (1987).

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40 Clonaje de genes por complementación
Teniendo la colonia mutante de cdc2, esta es crecida a temperatura normal, luego se transforma con una biblioteca de fragmentos de cDNA de levadura normal. Cada célula recibirá un plásmido con un fragmento de DNA. Luego las colonias son transferidas a la temperatura restrictiva y solo las colonias capaces de crecer son a las que se les introdujo el fragmento de ADN con el cdc2. A estas colonias se les extrae el plásmido y se clona y secuencia. La biblioteca de cDNA se forma a partir de mRNA que luego son transformados en DNA de cadena doble. Estos fragmentos luego son introducidos en un plásmido de expresión que permite la expresión del gen. Este gen se mantiene en el plásmido y es posible extraerlo haciendo una separación del ADN genómico y del ADN del plásmido, tal y como se hace en bacterias. De esta forma se aisló el cDNA que codificaba para el cdc2. Este plásmido luego fue secuenciado y se observó lo siguiente:

41 Cdc2 es una proteína kinasa, muy similar a CDC28 de By y con un motivo particular PSTAIRE
Esta evidencia unió ambas líneas de estudio, ya que se sospechaba que MPF era una proteína kinasa.

42 La unión de ambos estudios

43 Integración de By y Fy Es posible complementar cdc2 con cdc28 y viceversa 63% de identidad en la secuencia de aa Cdc2 ENTRADA A MITOSIS y cdc28 INICIO ? Homólogo de cdc2 en humanos, capaz de rescatar cdc2 Fy => sistema conservado

44 Integración de mutantes y MPF
Se logra purificar MPF 1 L huevos pocos ug de MPF 2 bandas 34 KDa y 46 KDa Se supuso que era cdc2 y cdc13 (ciclina) Anticuerpos lo demostró MPF tenía actividad kinasa Sustrato Histona H1

45 La ciclina y el ciclo celular
Es la ciclina la única proteína involucrada en la regulación del ciclo celular, su síntesis y degradación? Es la ciclina la única proteína involucrada en la oscilacion del CC

46 Sistema in vitro de ciclo celular
Extractos de células en ciclo celular. La técnica se base en romper suavemente los huevos de rana y recobrar el citoplasma. Los huevos son activados eléctricamente para reiniciar el ciclo celular, luego son presionados para remover el exceso de buffer y luego rotos mediante una centrifugacióna g La centrifugación separa los contenidos de los huevos en tres capas: lípidos arriba, la “yema” en la base y en el medio el citoplasma. Esta capa se recupera permitiendo recrear el ciclo celular in vitro. Luego se combina el extracto de citoplama con nucleos de espermas sin membrana plasmática. Al incubarse lo nucleos se decdondensan en nucleos de interfase y se duplica su DNA. Luego estos entran en mitosis, lo núcleos se rompen y los cromosomas se condensan. Al final de Mitosis, MPF se inactiva, y los cromosomas individuales se decondensan y luego se funden para formar un nucleo de interfase. Estos extractos completan de 3 a 5 ciclos in vitro Este sistema permite estudiar los componentes del ciclo celular como medir la actividad del MPF y la participación de otros genes.

47 Adición de mRNA de ciclina es capaz de restaurar divisiones
Murray, A. W., & Kirschner, M. W.(1989) Tecnica elimina todos los mRNA y luego adiciona el de ciclina. Adición de mRNA de ciclina es capaz de restaurar divisiones

48 ANTISENSE mRNA mRNA sintesis de Cyclin B esencial. Técnica solo elimina ciclina.

49 Eliminación de un fragmento de 90 aa (caja de destrucción) del terminal amino del gen de ciclina: destrucción necesaria para salir de mitosis.

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51 Inhibición de síntesis de proteína cicloheximida
Mitad de interfase Inicio de interfase Ciclina requerida para entrar en M Incremento de MPF depende de otros factores Más ciclina no acelera CC Más MPF si acelera CC Más cdc25 si acelera Menos wee1 si acelera

52 Fosforilación La modificación más común de postTD Actúan sobre aa-OH
Activa o inactiva proteínas Participa en cascada de señales 3 tipos: Ser/Thr, Tyr y Ser/Thr/Tyr Diferentes Kinasas diferente sustrato Wee1 solo actúa sobre cdc2 MPF actúa sobre muchos sustratos Las proteínas pueden tener varios sitios de fosforilación Fosfatasas: también clasificadas por su especificidad aa

53 Mutante del cdc2 en residuo Tyrosina 15
al parecer es un sitio de regulación negativa se divide en un tamaño menor no responde a daños en DNA Cdc2: también fosforilado en Thr 161 regulación positiva Cdc25 -: detiene ciclo en G2 muestra alta fosforilación de Tyr15 en cdc2 F15D: no puede ejercer fosforilación es fosforilado para activarse El mutante Cdc 25 no rescata. Cdc25 es una fosfatasa.

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56 Degradación de la ciclina Se requiere para inactivar MPF
Se asocia a moléculas de ubiquitina Ubiquitina es activada por MPF Los residuos de ubiquitina se unen a caja de destrucción

57 Autocontrol de MPF

58 Sustratos de MPF Estructura de Membrana Nuclear: filamentos de lamina ¿Tarea, otros sustratos?

59 Mutantes en otras kinasas
Wee1: fosforila Tyr 15 Mik1: fosforila Tyr 15 (redundante) Wee1-mik1: catástrofe

60 nimA y MPF: se requieren para M
Aspergilus nidulans: Nim: never in mitosis Bim: blocked in mitosis nimA: kinasa, actividad alta en mitosis y luego cae nimA++: entrada temprana en M, aún sin duplicar DNA nimA-: ciclo se detiene en G2, pero mantiene alta MPF nimT: homólogo de cdc25 nimT-: baja MPF, detiene ciclo en G2 nimT: alta actividad kinasa de nimA nimA y MPF: se requieren para M

61 Actividad kinasa asociada a NimA y mitosis
O’Donnell, K., Pu, R. T., & Osmani, (1991).

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63 Ciclo Celular en Mamíferos
Kaldis y Aleem, 2005 Concepción común CDK2 + CYC A or CYC E en G1/S CDC2 + CYCB en Mitosis Nuevo CDC2 + CYCE, B o A en G1/S CDC2 o CDK2 en G1/S

64 Ciclo Celular en Plantas
Hartig and Beck, 2005

65 Hartig and Beck, 2005

66 Jager et al., 2007 Plantas: 49 ciclinas, 10 clases: A, B y D en CC
CDK´s: A, B CDKA/CYCD y CDKB/CYCD CDKA: constitutiva, genera actividad Kinasa en G1 CDKB: actividad kinasa en S y M Ciclinas CYCD5: pico en G1 CYDD4: pico en G1/S CYCD++: G1 se acorta Regulación de CYCD: CYCD3: muy inestable v1/2: 7.5 min x ubiq, transducción de señales (nutrientes, hormonas) CYDD2: más estable, regulada a nivel de actividad de kinasa

67 Regulación de CDK Por asociación a ciclina
Jager et al., 2007 Regulación de CDK Por asociación a ciclina Por fosforilación (CAK: CDK activ.kinasas) CDKD/CYCH CDKF Inhibidores de CDK (KRP´s)

68 ENTRADA en S Jager et al., 2007 CYCD/CDKA inactiva RB (via P) RB E2F
CYC D se une a RB vía motivo LxCxE RB asociado a diferenciación RB RB/E2F:inactiva a E2F RB fosforilado no puede inactivar E2F (se da duplicación del ADN) E2F Factor de Elongación Activos durante S asociados a endoreduplicación Regulan genes de sintesis y replicación de DNA 5700 genes con sitios de unión para E2F (20 % genoma) Tipos E2F heterodimérico DP E2F monomérico (indep de RB) ELP, E2Fd, E2Ff, E2F, DEL

69 Modelo de la Transición G1/S en plantas
Dewitte and Murray, 2003

70 Ciclinas tipo A 10 tipos en Arbd, 3 subclases: A1, A2 y A3
Jager et al., 2007 Ciclinas tipo A 10 tipos en Arbd, 3 subclases: A1, A2 y A3 Expresión secuencial A3 -> A1 -> A2 CYCA3/CDKA: requerida p´re-entrar CC en S A1 y A2 durante S y G2/M

71 G2/M Control ppal por CYCB Arbd: 9 tipos, 3 subclases B1, B2, B3
Jager et al., 2007 G2/M Control ppal por CYCB Arbd: 9 tipos, 3 subclases B1, B2, B3 TC alta en G2 y pico al inicio de M TC regulada por MybA1, A2 y B MybA1 y A2: activadores MybB: represor

72 Jager et al., 2007 Ciclinas tipo B Los niveles muy regulados por proteólisis en metafase/anafase CYCB++: daños en mitosis CDKA/CYCB: colocaliza en PPB, huso, cromatina, fragmoplasma: dinámica de microtúbulos No se ha indentificado homólogos de Wee1 identificado en plantas cdc25: no ¿regulación?

73 Estudio de genes del CC en plantas