Rosa M. Suárez; 14/02/20131 Estudio sistemático de diversos modelos estructurales sencillos basados en cationes quinolizinio. Síntesis de librería, estudio.

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1 Rosa M. Suárez; 14/02/20131 Estudio sistemático de diversos modelos estructurales sencillos basados en cationes quinolizinio. Síntesis de librería, estudio de propiedades intercalantes ADN y evaluación de potencial actividad biológica Seminario de Equipo Heterobetaínas

2 Rosa M. Suárez; 14/02/20132 Cationes heteroaromáticos Cationes tipo azolio Heterociclos de 5 miembros Cationes tipo azolio Heterociclos de 6 miembros - Presentes en productos naturales - Colorantes fluorescentes - Surfactantes catiónicos - Biocidas - Compuestos antiproliferativos - Líquidos iónicos … - Presentes en productos naturales - Compuestos antiproliferativos (1984) - Inhibidores de proteínas quinasas de la familia CKII (1997) - Colorantes fluorescentes (2005) Cationes tipo quinolizinio Biciclo, 2 de 6 miembros, N + -cabeza de puente Ej. cationes indolo[2,3-a]quinolizinio

3 Rosa M. Suárez; 14/02/20133 Productos naturales con motivos quinolizinio (heteroaromáticos, cationicos, N + cabeza de puente) Quinolizinio Indolo[2,3-a]quinolizinio 1. Vaquero, Juan J.; Alvarez-Builla, J. Heterocycles Containing a Ring-Junction Nitrogen in Modern Heterocyclic Chemistry. Julio Alvarez-Builla, Juan J. Vaquero and Jose Barluenga Eds. 2011, WILEY-VCH Verlag, vol. 4, cap. 22.

4 Rosa M. Suárez; 14/02/20134 Precedentes Grupo: quinolizinios con interés farmacológico  Etapa clave de la síntesis. - Condensación de Westphal (mecanismo desconocido, fuertemente dependiente de la sal de cicloimonio de partida, del compuesto 1,2-dicarbonílico, base, disolvente, temperatura …). 2 - Condensación de Westphal intramolecular. 3 - Condensación de Westphal en fase sólida. 4 - Reacciones de metátesis. 5 2. Como referencia en nuestro grupo : “Aplicación de la condensación de Westphal para la síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN” ; tesis del Dr. Jorge G. Siro. Julio 1998, UAH. 3. “ Síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN via condensación de Westphal inter- e intramoleculr”, tesis del Dr. Valentín Martínez. Noviembre 1999, UAH. 4. “Síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN derivados de  -carbolina”; tesis del Dr. Enrique J. Benito. Abril 2004, UAH. 5. “Síntesis de quinolizinio y cationes análogos por reacción de metátesis”; tesis de la Dr. Ana Nuñez. Marzo 2006. Posteriores trabajos de tesis de Beatriz Abarca, Raúl Custodio…

5 Rosa M. Suárez; 14/02/20135  Objetivo : interés farmacológico. - Síntesis de estructuras “grandes” por condensación de Westphal. Estudio intercalación o bisintercalación ADN en algunos de los ejemplos. - Síntesis de un número limitado de dímeros simétricos, unidos a través de una cadena tipo diamida, 6,4 diamina (cuaternaria), 6,4 o alquino. 2 Estudio intercalación ADN. 6 2. “Aplicación de la condensación de Westphal para la síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN”; tesis del Dr. Jorge G. Siro. Julio 1998, UAH. 3. “ Síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN via condensación de Westphal inter- e intramolecular”, tesis del Dr. Valentín Martínez. Noviembre 1999, UAH. 4. “Síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN derivados de  -carbolina”; tesis del Dr. Enrique J. Benito. Abril 2004, UAH. 5. “Síntesis de quinolizinio y cationes análogos por reacción de metátesis”; tesis de la Dr. Ana Nuñez. Marzo 2006. Posteriores trabajos de tesis de Beatriz Abarca, Raúl Custodio… 6. “Nuevos agentes intercalantes sobre ADN: derivados de pirido [1,2-a] y piridazino [1,6-a] bencimidazolio”; tesis del Dr. Joaquín Pastor. Octubre 1994, UAH; “Nuevos agentes intercalantes de ADN derivados de  -carbolina”; tesis del Dr. Andrés Molina. Mayo 1995, UAH; y, más recientemente, ref. 4. 7. “Desarrollo y validación de nuevas metodologías para la caracterización de la interacción de ligandos con ADN. Estudio de la unión de cromóforos catiónicos heteroaromáticos con potencialidad intercalante”; tesis de la Dr. Verónica García. Julio 2009.  Resultado : trabajos (tesis, publicaciones, …) - Estructuras funcionalizadas con interés como intercalantes de ADN. Precedentes Grupo: quinolizinios con interés farmacológico

6 Rosa M. Suárez; 14/02/20136 1. “Nuevos agentes intercalantes sobre ADN: derivados de pirido [1,2-a] y piridazino [1,6-a] bencimidazolio”; tesis del Dr. Joaquín Pastor. Octubre 1994, UAH 2. “Nuevos agentes intercalantes de ADN derivados de  -carbolina”; tesis del Dr. Andrés Molina. Mayo 1995, UAH. 3. “Aplicación de la condensación de Westphal para la síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN”; tesis del Dr. Jorge G. Siro. Julio 1998, UAH. 4. “Síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN derivados de  -carbolina”; tesis del Dr. Enrique J. Benito. Abril 2004, UAH. Precedentes Grupo : Estructuras

7 Rosa M. Suárez; 14/02/20137 Precedentes Grupo : Estructuras

8 Rosa M. Suárez; 14/02/20138 Estructuras “base”

9 Rosa M. Suárez; 14/02/20139 Objetivos de nuestro proyecto  Síntesis + sencillos → ¡Compuestos no descritos! - Selección de compuestos 1,4-dinucleófilos más SIMPLES: revisión de precedentes equipo. › Síntesis de sales de cicloimonio (N + -NH 2 y N + -CH 2 CO 2 Et). - Condensación de Westphal (“end-game” series) con el 1,2-dicarbonílico más sencillo : DODO. › Optimización. Estudio sistemático de intercalación de ADN en función de la heterobetaína y evaluación de la actividad biológica de los productos.  Ensayos de Intercalación con el ADN → ¡No hay estudio sistemático! - Estudio de las propiedades de intercalación de ADN : screening “homogéneo” de los compuestos preparados (mismas condiciones método: análisis de curvas de fusión interacción ADN-comp). › Identificación de la “serie sencilla” más intercalante. → Diversificación. - Evaluación de la posible selectividad por ácidos nucleicos (AT o GC).  Potencial actividad biológica, fluorescencia … - Estudio de potencial actividad de los compuestos por citometría de flujo (colaboración ?) - Posible interés como colorantes fluorescentes.

10 Rosa M. Suárez; 14/02/201310 Estudio homogéneo del potencial intercalante Métodos para estudiar la interacción selectiva con ADN  “Footprinting”  Calorimetría  Espectroscopía RMN  Cristalografía de rayos X  Desplazamiento de la fluorescencia, FID (“Fluorescent Intercalator Displacement”) → Análisis de curvas de fusión interacción ADN – compuesto. Prof. Alberto Domingo. Librería de productos (≠ heterobetaínas sencillas) Intercalantes de ADN Ensayo de selectividad de secuencia ADN (preferencia AT vs GC) Ensayo de Intercalación con el ADN Selectividad vs estructura

11 Rosa M. Suárez; 14/02/201311 8. A. Domingo, V. García, Juan J. Vaquero, A highly sensitive and miniaturized fluorescence-based DNA melting assay for DNA-binding ligand screening and profiling, PCT/ES 210000264, 2010. Melting curve analysis of FRET-labeled DNA Nuevo método determinación selectividad por secuencia de ADN “FRET-labeled DNA melting assay” Ensayo basado en curvas de disociación térmica de ADN 8 → Ventajas vs métodos tradicionales:  Rápido  Bajo coste  Altamente reproducible  Muy poca cantidad de muestra  Aplicable a alto número de muestras (HTS)

12 Rosa M. Suárez; 14/02/201312 Librería compuestos tipo quinolizinio Ensayo de intercalación ADN Intercalantes ADN Ensayo fluorescente Compuestos fluorescentes Selectividad en función de estructura “DNA dyes” Colorantes ADN RT-PCR Teñido de células Ensayo antiproliferativo Potential antitumoral Interés de los compuestos sintetizados Ensayo de selectividad secuencia ADN

13 Rosa M. Suárez; 14/02/201313 Síntesis librería: compuestos “sencillos”  Compuesto 1,2-dicarbonílico más sencillo : glioxal → 1,4-dioxano-2,3-diol = “DODO”, 9 equivalente sintético (anh)  Etapa final común en síntesis de series : Condensación de Westphal..  Sales de alquil/amino cicloiminio más sencillas: › Aminación (NH 2,con MSH) o alquilación (CH 2 GEA = éster, acilo, nitrilo, … → CH 2 CO 2 Et, decarbox.) › YH 2 → CH 3 › Parte del heterociclo → quimioteca del equipo (mín. 3 ciclos, ?). 7 9. Angew. Chem.- Int. Ed. Eng. 1989, 588; J. Org. Chem. 1991, 4858. 10. MSH = O- hidroxilaminomesitilensulfonilo. 7. “Desarrollo y validación de nuevas metodologías para la caracterización de la interacción de ligandos con ADN. Estudio de la unión de cromóforos catiónicos heteroaromáticos con potencialidad intercalante”; tesis de la Dr. Verónica García. Julio 2009.

14 Rosa M. Suárez; 14/02/201314 Revisión de quimioteca del equipo: selección sales de cicloiminio Sales de benzoimidazolio y naftoimidazolio Sales de  -carbolinolio Sales de  -carbolinolios Sales de pirrolopirazinio Sales de pirrolopirimidinioSales de perimidinio Sal de  -carbolinolio 16 compuestos

15 Rosa M. Suárez; 14/02/201315 Trabajo realizado: serie benzoimidazolio y naftoimidazolio Preparación de O-hidroxilaminomesitilensulfonato (MSH) a escala multigramo. 11 Naftoimidazolio √ Quimioteca: EBM-007 Benzoimidazolio 11. Synthesis 1977, 198, 53; proced.exp. N- aminación con MSH nuestro equipo: Tetrahedron 1991, 47(35), 7329-7342; J. Org. Chem. 1999, 64(11), 3907-3915.

16 Rosa M. Suárez; 14/02/201316 Trabajo realizado: serie benzoimidazolio y naftoimidazolio  Condensación de Westphal. 3. “Aplicación de la condensación de Westphal para la síntesis de nuevos agentes intercalantes de ADN”; tesis del Dr. Jorge G. Siro. Julio 1998, UAH. Para la optimización, hace un estudio factorial en dos niveles y para condiciones óptimas sigue el método “simplex básico” descrito en Carlson, R. “Design and optimization in organic synthesis” Elsevier, Amsterdam 1992, 89. 12. Publicadas por el equipo en Tetrahedron 2000, 56, 2469-2472. Tesis Dr. Jorge G. Siro y publicación del equipo: optimización de condiciones de reacción entre compuesto 1,2- dicarbonílico sencillo y un sustrato “modelo” (N-amino-2-picolina). 3, 12 Parámetros considerados : › Equivalentes sintéticos: glioxal acuoso, dihidrogenosulfito de glioxal, DODO / nº eq = 1-3 › Base: Et 3 N, NaOAc, K 2 CO 3, KOH / nºeq.: 0.2-2 › Disolvente: EtOH, acetona, THF, CH 2 Cl 2, DMF › Temperatura reacción: 30 hasta 80ºC → Condiciones optimizadas (una sal de cicloiminio): 1.2 eq DODO, 1.2 eq Et 3 N, DMF, 70ºC 12

17 Rosa M. Suárez; 14/02/201317 Trabajo realizado: series  - y  -carbolinas  -carbolina  -carbolinas √ Quimioteca: PVL-027  Síntesis  -carbolina N + -aminada  Síntesis  -carbolina N + -alquilada

18 Rosa M. Suárez; 14/02/201318 Trabajo realizado: series  -carbolinas Ensayo por microondas (doméstico). rso-017. 13  Síntesis 4-cloro-2-metilpiridina Ensayo calentamiento convencional. rso-028. 13 13. Publicado por el grupo en Tetrahedron Lett. 1993, 34(16), 2673-2676.  Más tiempo de irradiación (rso-019): no producto.  Calibración equipo necesaria ?  Síntesis heterociclo: sustitución benzotriazol + descomposición

19 Rosa M. Suárez; 14/02/201319 Trabajo realizado: series  -carbolinas rso-060 rso-061 Repetir con H 3 PO 4 (+ cantidad) y continuar/finalizar síntesis  Descomposición triazoderivado intermedio + ciclación =  -carbolina. La nomenclatura … inorgánica !! Publicación del equipo 13 - texto: “with pyrophosphoric acid” › Ácido pirofosfórico (ácido difosfórico): H 4 P 2 O 7 ; Aldrich, Fluka, Acrôs …CAS [2466-09-3] Publicación del equipo 13 - esquemas: H 2 P 2 O 7 → ?? › Ensayo con ácido polifosfórico (ácido ortofosfórico, ácido fosfórico(V)): H 3 PO 4 CAS [7664-38-2] 13. Publicado por el grupo en Tetrahedron Lett. 1993, 34(16), 2673-2676.

20 Rosa M. Suárez; 14/02/201320 Repetir con H 3 PO 4 (+ cantidad) y continuar/finalizar síntesis Trabajo a realizar: series  -carbolinas

21 Rosa M. Suárez; 14/02/201321 Trabajo realizado: series pirrolopirazinio  Síntesis heterociclo precursor  Síntesis pirrolopirazinio N + -aminado  Síntesis pirrolopirazinio N + -alquilado

22 Rosa M. Suárez; 14/02/201322 Trabajo realizado: series pirrolopirimidinio › rso-005; 2 eq fenilendiam., calent. 30 min → no producto › rso-006; 1 eq fenilendiam., calent. 4h → no producto › Importancia orden adición: Tetrahedron Lett. 2006, 47, 799-801 - (no se llegó a probar).  Síntesis heterociclo precursor; condiciones Dña Patricia Sánchez Alonso. √  Síntesis heterociclo precursor; condiciones tesis del Dr. Valentín Martínez, 1999 4 – No reproducible ?

23 Rosa M. Suárez; 14/02/201323 Trabajo realizado: series pirrolopirimidinio  Síntesis pirrolopirimidinio N + -aminado  Síntesis pirrolopirimidinio N + -alquilado

24 Rosa M. Suárez; 14/02/201324 Trabajo realizado: series perimidinio  Síntesis perimidinio N + -aminado  Síntesis heterociclo precursor

25 Rosa M. Suárez; 14/02/201325 Trabajo realizado: series perimidinio  Síntesis perimidinio N + -alquilado  Propuesta: invertir orden de alquilaciones.

26 Rosa M. Suárez; 14/02/201326 Trabajo realizado: vista general Naftoimidazolio Benzoimidazolio  -Carbolina  -Carbolinas √ Quimioteca: EBM-007  -Carbolinas Pirrolopirazinios Pirrolopirimidinio Perimidinio √ rso-034-s √ Quimioteca; PVL-27 √ rso-053-s +Purif. pdte. √ rso-056-s +Purif. pdte. √ rso-089-s Westphal pdte. √ rso-035-B +Purif. pdte. √ rso-051-s Westphal pdte. X Pdte. N-alquil; Westphal √ rso-056-B +Purif. pdte. √ rso-061-B Repetir (+cantidad); separ.isóm.; N-amin/N-alquil.; Westphal √ rso-090-B Pdte.Rdto.;Westphal X Pdte. N-alquil; N-metil.; Westphal

27 Rosa M. Suárez; 14/02/201327 Trabajo en proceso 1  Completando la síntesis de librería. - Concluir síntesis de los productos indicados (sales de cicloiminio + Westphal). - Mayor purificación de algunos compuestos finales. › Trituración y lavados de los productos crudos. › Purificación por filtración sobre sílice o cromatografía de intercambio catiónico. 2  Condensación de Westphal. Optimización en función de la sal de cicloiminio. 14 › Para cada tipo de sal de cicloiminio. Condiciones tipo seleccionadas: √ 1. DODO (1.2 eq), Et 3 N (1.2 eq), DMF, 70ºC; Siro: Tetrahedron 2000, 56, 2469-2472. √ 2. DODO (1 eq), NaOAc (anh, 1 eq), acetona, 56ºC; Tetrahedron 1991, 47(35), 7329-7342. 3. DODO (1.1 eq), Et 3 N (1.1 eq), EtOH (t.a. o refl.); Dña. Patricia Sánchez Alonso. 14. No pretende ser una optimización “completa” (requeriría más tiempo –fin contrato-).

28 Rosa M. Suárez; 14/02/201328 Trabajo por hacer 1  Completar la síntesis y pendiente toda la caracterización de productos. › Intermedios no descritos. › Casi todos los productos finales (nuevos). 2  Informes. › Informe de mi labor desempeñada para el vicerrectorado de investigación UAH. › Informe grupo: Parte experimental completa para el equipo. Agradecimientos Prof. Juan Jose Vaquero / Prof. Julio Álvarez-Builla Prof. David Sucunza Demás profesores y compañeros del equipo heterobetaínas Financiación : Contrato postdoctoral del programa propio de la UAH

29 Rosa M. Suárez; 14/02/201329 Seminario Grupo Heterobetaínas Dept. Química Orgánica II