PCR en Tiempo Real.

Presentación del tema: "PCR en Tiempo Real."— Transcripción de la presentación:

1 PCR en Tiempo Real

2 ADN molde Primers Taq polimerasa dNTPs MgCl2 Buffer Fluorocromo

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4 PCR en Tiempo Real PCR convencional

5 Ventajas Sensibilidad Cuantificación
Monitoreo de todo el procedimiento Disminución del riesgo de contaminación Automatización Amplicones pequeños Amplio rango dinámico Transcripción reversa

6 Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos
Sist. de Detección Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sondas fluorescentes Primers fluorescentes No específico Curva de disociación Económico SYBR Green

7 SYBR Green

8 Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos
Sist. de Detección Colorantes de unión al ADN Oligonucleótidos específicos Sondas fluorescentes Primers fluorescentes No específico Curva de disociación Económico SYBR Green

9 FAM: fluoresceína JOE: dimetoxi-dicloro-fluoresceína TAMRA: tetrametil-rodamina ROX: rodamina X

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11 LUX™ primers

12 Sondas TaqMan®

13 Molecular Beacons ®

14 Sondas Scorpions™

15 A mayor producto de amplificación mayor fluorescencia!!!!

16 Muestra ΔRn Rn Threshold Control Negativo Basal Ct Número de ciclos

17 Rn: intensidad de la señal emitida por el reporter normalizada por la emisión del colorante utilizado como referencia pasiva (ROX). Threshold: umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia. Basal: ciclos iniciales de la PCR (3-15) en los cuales hay cambios mínimos en la emisión de fluorescencia. Ct: número de ciclo en el cual la fluorescencia emitida supera el threshold. Está inversamente correlacionado con el log. del núm. inicial de copias. ΔRn: magnitud de fluorescencia generada durante la PCR.

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23 Controles endógenos: β-Actina rARN 18S GAPDH β2-microglobulina

24 Métodos de cuantificación
Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa a) Método del ΔΔCt: compara los Ct del gen testeado y del gen de referencia (ΔCt) en cada muestra, y luego se comparan los ΔCt de las muestras experimentales con respecto a los calibradores. (EFICIENCIA 100%). r= 2 -(ΔCtm-ΔCtc) r= 2 -(ΔΔCt)

25 b) (Etarget)ΔCt target (control-muestra) r= (Eendógeno) ΔCt endógeno (control-muestra) E= 10 [-1/ pendiente]-1

26 Curva de disociación Contenido de GC. Secuencia y tamaño del amplicón.

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28 Ej. Cuantificación Relativa (SYBR Green) mediante el método del 2 -(ΔΔCt)
Objetivo: medir la expresión de TRalfa en leucocitos PMN de ratas controles e hipotiroideas. Endógeno: beta-actina. Tejido calibrador: hígado de rata.

29 Curva de Rango Dinámico TRalfa

30 Curva de Rango Dinámico Beta Actina

31 Puesta a punto: cDNA Primers (Calibrador!!!!!)

32 Target: TRalfa (m y calibrador)
Master Mix Endógeno: BetaActina(m y c) NTC!!!

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39 Ej. Discriminación Alélica (Taqman)
Objetivo: determinar genotipo homocigota o heterocigota para polimorfismo en gen de PPARγ2. Alelos: Ala12 Pro12

40 Alelo 1 Alelo 2 Sonda 1 (FAM) Sonda 2 (VIC) Match Match Mismatch

41 Homocigota alelo 1: Heterocigota: Homocigota alelo 2:

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