Grupo: _4 Unidad 2, paso 4 Técnicas del ADN recombinante, PCR y tipos de PCR José Alberto Montero Amaris Cead Corozal, Noviembre de 2019.

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1 Grupo: 201529_4 Unidad 2, paso 4 Técnicas del ADN recombinante, PCR y tipos de PCR José Alberto Montero Amaris Cead Corozal, Noviembre de 2019

2 TÉCNICAS PARA TRABAJAR CON GENES A continuación comentaré, brevemente algunas de las técnicas más usuales para trabajar con genes, o con fragmentos de DNA, que hoy día se utilizan prácticamente de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios de Biología Molecular: electroforesis, hibridación con sondas de ácidos nucleicos, secuenciación, PCR y microchips.[1]

3 La electroforesis es una técnica que permite la separación de macromoléculas que tienen una carga eléctrica y que por tanto se moverán cuando se sometan a un campo eléctrico, obviamente en la dirección fijada por el signo de su carga eléctrica. [2] ELECTROFORESIS

4 ELECTROFORESIS VERTICAL En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas. [2]

5 ELECTROFORESIS HORIZONTAL La electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN. [2]

6 OTROS TIPOS DE ELECTROFORESIS La electroforesis en campo pulsado, mayormente usada para separar fragmentos muy grandes de ADN (ADN genómico), La electroforesis bidimensional se usa en un análisis más sofisticado de las proteínas. A diferencia de la electroforesis en una dimensión en el que se puede resolver cerca de 50 bandas, la electroforesis de dos dimensiones permite resolver 2500 manchas de polipéptidos La electroforesis de capilaridad permite separar una gran variedad de moléculas entre las cuales tenemos: proteínas, péptidos, aminoácidos, ácidos nucleicos, iones inorgánicos, bases orgánicas, ácidos orgánicos y células en general. [2]

7 HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS Es la construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios usando la complementariedad de bases. Se trata, por tanto, de un proceso de unión de dos cadenas complementarias de ADN, ARN o de ADN y ARN para formar una molécula de ácido nucleico de doble cadena. Es un método muy versátil que permite estudiar el grado de relación genética entre dos ácidos nucleicos. También permite la detección de fragmentos de DNA que son complementarios a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas). [3]

8 Para la identificación de un determinado fragmento o gen es necesario disponer de alguna sonda ya conocida. Una sonda es un DNA aislado, purificado y ya identificado (también puede ser un RNA) que nos va a permitir identificar un DNA homólogo entre otros muchos desconocidos, o bien que nos va a permitir identificar un DNA de interés aunque totalmente «desconocido» pero que suponemos que tiene una cierta homología con el que utilizamos como sonda (por ejemplo, por ser un gen equivalente en una especie próxima). Este reconocimiento entre DNAs homólogos o que tienen una cierta homología se basa en el proceso de hibridación de ácidos nucleicos. [1] HIBRIDACIÓN CON SONDAS

9 SECUENCIACIÓN DE DNA La secuenciación de DNA es un proceso que se lleva a cabo en la mayoría de los laboratorios de forma rutinaria y con frecuencia en aparatos de secuenciación automática. Se emplea para la lectura de la secuencia de bases nitrogenadas de los nucleótidos de una molécula de ADN. Existen básicamente tres métodos de secuenciación: Método químico. Método enzimático. Secuenciación automática. [1][4]

10 Es una ingeniosa técnica que permite obtener en pocas horas millones de copias de cualquier fragmento de DNA en un tubo de ensayo, es decir «in vitro». Éste método de amplificar DNA fue ingeniado por Kary Mullis (1985). [1] REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

11 FASES DE LA PCR Desnaturalización: la molécula de ADN que va a copiarse se calienta para que se desnaturalice (esto hace que se separen las dos hebras complementarias). Hibridación: se añaden nucleótidos, cebadores y una ADN polimerasa resistente al calor (se utiliza la ADN-polimerasa llamada Taq de una bacteria que vive en aguas termales, Thermus aquaticus, así la enzima puede trabajar a altas temperaturas). Se induce a un enfriamiento brusco de la mezcla, lo que genera la unión de los cebadores con las hebras de ADN. Replicación: el ADN se sintetiza o amplifica. Cada una de las hebras del ADN desnaturalizado es copiada por la ADN- polimerasa. Las cadenas recién formadas son separadas de nuevo por el calor y comienza otro nuevo ciclo de copias. [1]

12 TIPOS DE PCR PCR anidada Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicón se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial. PCR de extensión solapada (Mutagénesis) Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primmers) mutagénicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutación. Se usan los productos en otra reacción para producir el ADN mutado de longitud completa. PCR in situ Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. PCR múltiple Se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN. [3] Variaciones de la PCR básica PCR específica de alelo PCR "assembly": PCR asimétrica: PCR de colonia PCR hot-start: PCR específica de intersecuencia (ISSR): PCR inversa PCR específica de metilación (MSP) Amplificación Múltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA) PCR cuantitativa: PCR-TAIL: PCR touchdown PAN-AC: Ciclo térmico rápido para PCR. [3]

13 A principios de los años noventa, se desarrolló una nueva tecnología denominada de los biochips. En ella confluyen la microelectrónica y la biología molecular junto con la química combinatoria, la informática y el tratamiento de señales. El chip de DNA (gene- chip o genomechip) permite analizar en pocas horas los constituyentes de una mezcla compleja que contenga miles de secuencias diferentes de DNAs o de RNAs. [1] BIOCHIPS

14 BIBLIOGRAFIA [1] Morcillo E., Cortés E., & García J.L. (2013). Biotecnología y alimentación. Tema 5.10. Técnicas para trabajar con genes. Pág. 153 – 171. Recuperado de: https://ebookcentral-proquest- com.bibliotecavirtual.unad.edu.co/lib/unadsp/reader.action?docID=3216171&ppg =153 [2] Yabar, C. (2014). Manual de Procedimientos de Electroforesis para Proteínas y ADN. Consultado de: https://www.researchgate.net/publication/261136098https://www.researchgate.net/publication/261136098 [3] Peña, A.M. (2015). Aporte Individual biotecnología. Consultado de: https://es.slideshare.net/marcianita624/biotecnologa-unad https://es.slideshare.net/marcianita624/biotecnologa-unad [4] Senna, A. (S.f). Tecnologías que se utilizan para el estudio del ADN. Consultado de: https://es.slideshare.net/biologiaquimicamontclar/tecnologas-que-se-utilizan- para-el-estudio-delhttps://es.slideshare.net/biologiaquimicamontclar/tecnologas-que-se-utilizan- para-el-estudio-del

15 GRACIAS POR SU ATENCIÓN