Métodos diagnósticos usados en inmunología

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1 Métodos diagnósticos usados en inmunología

2 Introducción Existen múltiples técnicas inmunológicas que sirven para:
Cuantificar y detectar An o Ag específicos mediante la interacción antígeno anticuerpo. Detectar, enumerar y fraccionar las células inmunocompetentes. Evaluar la inmunidad celular.

3 Introducción (2) 4. Evaluar los componentes del complemento y su función. 5. Trasplantes.

4 Métodos inmunoquímicos
Las pruebas serológicas son las que estudian los anticuerpos en el suero. Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son los que se basan en la especificidad de la unión Ag-An o sea los métodos inmunoquímicos. Recordemos que los Ag-An interactúan por complementariedad espacial y que ambos se asocian por puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, fuerzas electrostáticas y fuerzas de van der walls todas estas uniones son no covalentes. Las uniones Ag-An son reversibles.

5 Métodos inmunoquímicos (2)
La especificidad de esa unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos hacen que estos métodos se empleen ampliamente. Además de estos métodos basados en la unión Ag- An existen otros basados en la respuesta inmunitaria.

6 Métodos inmunoquímicos (3)
Criterios que determinan cuál es la mejor prueba diagnóstica: Costo Sensibilidad: Habilidad de una prueba para detectar todos los verdaderos positivos. Capacidad de una prueba para detectar a los enfermos. Estas pruebas se usan como screening c) Especificidad: Habilidad de una prueba para detectar solo a los verdaderos positivos.

7 Métodos inmunoquímicos ( 4)
O sea estas pruebas tienen la capacidad para detectar a los sanos. Ellas se usan para confirmación diagnóstica. Tanto la especificidad como la sensibilidad van de la mano y cuando se afecta una también lo hace la otra. Cuando aumenta una la otra disminuye y viceversa.

8 Métodos inmunoquímicos (4)
d) Rapidez. e) Disponibilidad. Principales métodos inmunoquimicos: Técnicas de precipitación. Técnicas de aglutinación. Técnicas de inmunofluorescencia. Técnicas de RIA. Técnicas de enzimoinmunoanálisis. Técnicas nefelométricas. Cromatografía de afinidad. Inmunoprecipitación e inmunoblotting

9 Técnicas de precipitación
En estas técnicas se requiere que tanto el Ag como el An estén en un medio fluído en el que sea posible la precipitación del complejo antígeno anticuerpo. Son fáciles de realizar y en general son cuantitativas. Requieren de grandes cantidades de Ag y An para medir el precipitado formado por lo que no son muy usadas.

10 Técnicas de precipitación (2)
El Ag que se usa en estas técnicas debe ser soluble y multivalente para que forme un entrecruzamiento o red con los anticuerpos y se produzca el precipitado. Estas pruebas pueden realizarse en : Medio líquido. Medio semisólido ( las que usan agar)

11 Técnicas de precipitación (3)
Ventajas: Son rápidas. No costosas. Desventajas: Poca sensibilidad. Requieren de grandes cantidades de Ag y An.

12 Técnicas de precipitación (4)
Entre ellas tenemos; Inmunoprecipitación simple. Doble precipitación u Ouchterlony. Inmunoelectroforesis. Inmunodifusión radial simple o de Manzini.

13 Inmunoelectroforesis
En esta técnica hay una combinación de electroforesis, difusión y precipitación lo que permite la identificación de proteínas individuales que pueden estar presentes en suero, orina u otros líquidos biológicos. Usos: Discrasias de células plasmáticas. Hipo e hipergammaglobulinemia Trastornos autoinmunes. Enfermedades neurológicas que cursan con aumento de proteínas en el LCR.

14 Inmunodifusión radial simple o de Manzini
Usos: Identificación y cuantificación de las Igs. Identificación de factores del complemento. Identificación y cuantificación de transferrina, proteína C reactiva y alfa feto proteína. Es un método rápido y práctico pero no tiene una elevada sensibilidad. Es una técnica cuantitativa. Ella permite cuantificar Ag porque la concentración de Ag es proporcional a el área del círculo de precipitación.

15 Técnicas de aglutinación
Son semicuantitativas y más difíciles de realizar que las de precipitación pero más sensibles. En ellas el Ag se encuentra formando parte o unido a células , bacterias o partículas y la reacción Ag-An se puede detectar por el aglutinado celular o bacteriano formado. Generalmente las partículas que se usan son partículas de látex.

16 Técnicas de aglutinación (2)
El látex se une a la Fc de IgM ó IgG, los fragmentos Fab quedan expuestos y se unen al Ag que se encuentra en la muestra produciéndose un entrecruzamiento entre las partículas e látex que dan como resultado una aglutinación visible. El antígeno de estas reacciones es particulado.

17 Técnicas de aglutinación (3)
Ventajas: Son sencillas. Rápias. Económicas. Cuantitativas y semicuantitativas. Sensibles Específicas.

18 Técnicas de aglutinación (4)
Desventajas: Difíciles de cuantificar. Son reacciones heteroespecíficas donde se obtienen varias respuestas.

19 Técnicas e aglutinación (5)
Usos: Tipificar glóbulos rojos. Identificar bacterias. Clasificación: Directa Indirecta.

20 Técnicas de aglutinación (6)
Usos de la hemaglutinación directa: Tipificación de GR y Rh. Usos de la hemaglutinación indirecta: Medida de la gonadotropina coriónica en el embarazo . Detección del Ag de la hepatitis B. Detección del factor VIII de la coagulación para el diagnóstico de hemofilia.

21 Técnicas de aglutinación (7)
La hemaglutinación indirecta se basa en el principio de inhibición de la hemaglutinación. ¿Cómo se hace? Uno a GR lavados la sustancia que quiero identificar o cuantificar. Cuando estos GR sean puestos en presencia de An preparados frente a dicha sustancia los anticuerpos se van unir a ella

22 Técnicas de aglutinación (8)
y no a los GR y por lo tanto no se producirá la aglutinación. Si el suero problema que añado no tiene la sustancia que quiero identificar entonces los anticuerpos se unirán a los GR y se producirá la hemoglutinación. Por lo tanto aglutinación significa ausencia de la sustancia a estudiar y no aglutinación presencia de la sustancia a estudiar.

23 Técnica de aglutinación (9)
Pruebas de aplicación clínica que emplean reacciones de aglutinación. Prueba de Coombs o de antiglobulina se usa en el diagnóstico de anemias hemolíticas. Prueba de floculación de bentonita, se usa para detectar An contra trichinella y contra DNA. Prueba de fijación del látex se usa para la detección del factor reumatoideo. Prueba de Roose – Waaler también para detectar factor reumatoideo es menos sensible y más específica que la anterior.

24 Técnicas de aglutinación (10)
5. Determinación de antiestreptolisina O. 6. Prueba de Paul Bunell ( detectar infecciones por el virus de Epstein Barr.

25 Técnicas de inmunofluorescencia
La IF es la propiedad de ciertas moléculas que al ser irradiadas con energía electromagnética adecuada emiten radiación de longitud de onda característica permitiendo su identificación y cuantificación. La molécula que fluoresce se fija al anticuerpo y se incuba el tejido o célula con el An marcado y es detectada usando luz UV Los fluorocromos utilizados son; fluoresceína, rodamina, texas red, Cy3, Cy5. Son más sensibles que la prueba de fijación del complemento y menos que la hemaglutinación.

26 Técnicas de inmunofluorescencia (2)
Usos: Cuando los An no pueden ser puestos en evidencia por las técnicas de aglutinación, precipitación o fijación del complemento. Identificar pequeñas cantidades de An fijados a células o tejidos. Detectar autoanticuerpos. Determinación cuantitativa de subpoblaciones linfocitarias. Ella puede ser: Directa Indirecta

27 Técnicas de inmunofluorescencia (3)
Ventajas de la IFD: Es un procedimiento corto y tiene menos probabilidad de error. No es necesario realizar cultivos. Desventaja de la IFD; Es necesario marcar cada An necesario para la sustancia a investigar.

28 Técnicas de inmunofluorescencia (4)
Usos de la IFD: Identificación de Ag virales ( virus respiratorios, herpes virus, etc). Identificación de otros microorganismos ( legionela pneumófila, S. pyogenes, clamidia trachomatis, giardia lamblia).

29 Técnicas de inmunofluorescencia (5)
Ventajas de la IFI: a) Mayor sensibilidad que la directa. b) Posibilidad de usar un An secundario para detectar An primarios. c) Poder cambiar la especificidad del An secundario para detectar la clase de An presente en la muestra.

30 Técnicas de inmunofluorescencia (6)
Desventajas de la IFI: Procedimiento más largo que la directa y por lo tanto hay mayores probabilidades de error. Poca sensibilidad. Díficil de estandarizar. No es automatizada. Necesita personal especializado. Costosa.

31 Técnicas de inmunofluorescencia (7)
Usos clínicos de estas técnicas; Identificación de LB y T en sangre. Detección de anticuerpo antinucleares. Detección de Ig en tejidos. Deptección de componentes del complemento en tejidos. Detección de An específicos fijados a tejidos. Identificación rápida de microorganismos en tejidos o cultivos. Identificación de Ag especifícos de tumores en tejidos neoplásicos.

32 Técnicas de inmunofluorescencia (8)
Citometría de flujo: Es una técnica de inmunofluorescencia, a través de ella se hace el análisis de una suspensión de células vivas marcadas con un fluorocromo y se mide la cantidad de fluorescencia emitida por las células. La suspensión celular se hace circular en forma de gotas microscópicas y se pasan por un campo de detección atravesado por un potente rayo láser el cual activa la fluorescencia. Mediante sensores específicos se analizan y cuantifican las poblaciones en estudio. No es útil para evaluar funcionalidad de LT.

33 Técnicas de inmunofluorescencia (9)
Usos de la citometría de flujo: Análisis fenotípico y funcional de LB y T y de todas aquellas células que tengan un An que las identifique A través de ella se identifica estirpe celular, estadio de maduración o estado de activación. Para cuantificar LB se usa el CD19 y para los LT el CD3,CD4, CD8

34 Técnicas de inmunoensayo
Son pruebas que usan inmunocomplejos para medir la presencia de un analito específico en una muestra. Este analito puee ser un antígeno o un anticuerpo. Ellas usan una señal que pueda medirse. Todos los inmunoensayos requieren de material marcado para medir la concentración del Ag o el An.

35 Técnicas de inmunoensayo (2)
Estas marcas se llaman etiquetas y pueden ser: Isotopos radiactivos ( RIA). Enzimas ( ELISA). Sondas de DNA. Reporteros fluorogénicos( EPIA o inmunoensayo e polarización fluorescente) Electroquimioluminiscentes ( CMIA o inmunoensayo magnético quimioluminscente)

36 Técnicas de inmunoensayo (3)
Los inmunoensayos pueden ser: Homogéneos: No requieren separación del inmunocomplejo. Heterogéneos: Requieren separación del inmunocomplejo. Ambos pueden ser: Competitivos. No competitivos.

37 Técnicas de inmunoensayo
Radioinmunoanálisis (RIA). Aquí el An se une a un isotópo radioactivo generalmente Yodo 125 ó 132. Se establece una competencia para unirse a An específicos entre la sustancia a cuantificar y cantidades conocidas de la misma sustancia marcada con el isótopo, por lo que a mayor cantidad de sustancia a cuantificar menor será la sustancia radioactiva que se una al An y viceversa.

38 Técnicas de inmunoensayo(2)
Existen varios tipos de RIA: Directo Inhibición. Sandwich ( más usada) Desventajas: Peligroso. Necesidad de instalaciones adecuadas para su realización. Caducidad rápida de los isótopos.

39 Técnicas de inmunoensayo (3)
2. RAST que es un radioinmunoensayo para IgE específica de antígeno. 3. ELISA ( enzimoinmunoanálisis). Esta técnica tiene como objeto incrementar la especificidad del inmunoensayo. En ella la identificación de complejos inmunes se hace igual que en el RIA pero usando enzimas unidas al An o al Ag en vez de radioisotópos. Las enzimas más usadas son: peroxidasa, galactosidasa o glucosa oxidasa.

40 Técnicas de inmunoensayo (4)
Aquí el Ag inmovilizado se detecta mediante el An unido a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color u otro tipo. Se usa en muchos laboratorios para ver si un An particular está presente en la sangre de un paciente. Esta técnica puede dar lugar a falsos positivos y negativos.

41 Técnicas de inmunoensayo (5)
Tipos de ELISA: Directo o competitivo. Indirecto o no competitivo. Sandwich ( más usada). Usos: Dosificación de hormonas. Detección de Ag de la hepatitis. Sustancias que se encuentran en baja concentración.

42 Técnicas de inmunoensayo (6)
Usos: Detección de Ag y An de virus, bacterias, hongos o parásitos. Detección de inmunocomplejos: Anti DNA. Anti histonas Detección de Ag asociados a tumores: Ag prostático. Ag ovárico ( Ca 125).

43 Técnicas de inmunoensayo /7)
c) ACE. d) Alfafetoproteína. Detección de anticuerpos contra ag de tejidos: Antitiroglobulinas. Antimicrosomal. Antifosfolípidos ( cardiolipinas)

44 Técnicas nefelométricas
En estas técnicas los complejos Ag-An crean una mezcla de nubosidad o turbidez que se determina por la refracción de dichos complejos al pasar rayos de luz por el tubo donde ellos se encuentran, usualmente usamos rayos láser. Detecta An no precipitantes, pero se usa más en la detección de Ag que de An. Es posible analizar por este método muestras de volumen muy pequeños. Es un procedimiento rápido y sensible. Se usa para cuantificar Igs y complemento.

45 Cromatografía de afinidad
Se usa para obtener un Ag o un An puro a partir de una solución. En esta técnica el Ag o el An está unido por sus grupos aminos libres a las partículas de Sepharose activadas con bromuro de cianógeno.

46 Inmunoprecipitación e inmunoblotting
Transferencia de proteínas o blotting supone la inmovilización de las proteínas sobre membranas sintéticas ya sea por transferencia o por aplicación directa, seguido de su detección empleando sistemas diseñados para la tinción de blot. Es una técnica muy útil cuando se asocia a electroforesis en gel SDS-poliacrilamida. Se usa para purificar proteínas En la mayoría de los casos el Ag se marca incubándolo con un precursor radioactivo aunque muchos Ag pueden detectarse por medios que no requieren marcaje directo.

47 Inmunoblotting (2) Los inmunocomplejos se analizan generalmente por electroforesis en gel aunque pueden usarse otras técnicas como: estudios enzimáticos, unión a ligandos, inmunizaciones, inmunoblotting, etc.

48 Inmunoblotting (3) Ejemplos de estas técnicas; Western Blot.
Se usa para determinar presencia y cantidad de Ag y An específicos. Se asocia con electroforesis en gel SDS- poliacrilamida. Es el estudio confirmatorio más empleado en el diagnóstico de VIH.

49 Inmunoblotting(4) b) Dot Blot.
Aquí se transfiere la muestra en forma de una pequeña gota circular de una solución concentrada a la membrana. La absorción de la gota provoca la adhesión de la proteína a la membrana quedando en forma de mancha o blot.

50 Inmunoblotting (5) Slot Blot.
Es igual a la anterior pero aquí la proteína se aplica en forma de línea. Ventajas de trabajar con proteínas fijadas a membrana: Son más rápidas de teñir y desteñir. Detecta cantidades menores de proteínas. El blot es un registro cómodo y conveniente de manipular el gel. Las membranas son más fáciles de manipular que el gel.

51 Inmunoblotting (6) Otras técnicas de inmunoblotting: Southern Blot.
Detecta ciertas secuencias de DNA. b) Northern Blot. Identifica RNA.

52 Otras técnicas basadas en la unión Ag -An
Marcaje de An con ferritina u oro coloidal. Tanto el hierro como el oro coloidal son opacos a los electrones y se ven por microscopía electrónica. Tanto el hierro como el oro coloidal se unen al An mediante ligandos bivalentes. Se usan en inmunohistología, inmunocitología animal humana o vegetal aplicado directamente sobre células o secciones de tejidos.

53 Otras técnicas basadas en la unión Ag – An (2)
2. Técnicas quimioluminiscentes. Los marcadores quimioluminiscentes son sustancias capaz de emitir luz cuando al absorber la energía de una reacción química oxidativa son colocadas en estado de excitación electrónica. Estos marcadores son de gran estabilidad y pueden almacenarse durante mucho tiempo por lo que constituyen una alternativa al uso de isotópos en el inmunoanálisis.

54 Pruebas para evaluar el sistema del complemento
Determinación de C3, C4, inhibidor de C1. CH50 o complemento hemolítico total ( valora la funcionalidad de la vía clásica). AH 50 ( valora la funcionalidad de la vía alterna). Prueba de fijación del complemento.

55 Prueba de fijación del complemento
Esta prueba a diferencia de las anteriores está basada en la respuesta inmunitaria. Existen muchas reacciones Ag - An que activan el complemento lo que produce lesión y destrucción de la célula, cuando ocurren in vitro pueden no dar ninguna manifestación visible por lo que se hace necesario usar un sistema indicador que generalmente va a ser glóbulos rojos de carnero y An contra ellos.

56 Prueba de fijación del complemento (2)
Cuando examino una muestra frente a este sistema indicador puede ocurrir; No haya lisis en el sistema indicador. Esto indica que en la muestra analizada existen Ag y An que van a activar el complemento y este va a ser consumido por esta reacción.

57 Prueba de fijación del complemento (3)
b) Haya lisis en el sistema indicador. Significa que en la muestra analizada no existen Ag ni An que activen el complemento el cual que da disponible para el sistema indicador. .

58 Prueba de fijación del complemento (4)
Resumiendo. Si hay lisis no hay Ag ni An en la muestra analizada y viceversa. Una prueba de aplicación clínica que usa esto es la prueba de Wassermann para el diagnóstico de la sífilis.

59 Pruebas para evaluar inmunidad celular
Intradermoreacción. Muy útil para medir el grado de sensibilización de un organismo frente a un Ag con el que supuestamente ha estado en contacto. Los Ag inyectados intradérmicamente son reconocidos por LTh sensibilizados los cuales son estimulados de nuevo y producen citocinas y activan los macrófagos.

60 Pruebas para evaluar inmunidad celular (2)
2. Test de linfoproliferación o transformación linfoblástica. Es un test para evaluat LT memoria. 3. Test de inhibición de la migración de macrófagos. Mide la producción de factor inhibidor de macrófagos (MIF) producido por LTh sensibilizados frente al Ag cuando in vitro se enfrentan al mismo Ag.

61 Pruebas para evaluar la inmunidad celular (3)
4. Medición de blastogénesis. Se cultivan los linfocitos evaluando su respuesta a Ag específicos o con varios mitógenos que provocan mitosis. La transformación blástica se mide por la capacidad que tiene el Ag de inducir inmunoproliferación.

62 Pruebas para evaluar inmunidad celular(5)
5. Test de rosetas. Los LT forman rosetas cuando se unen a GR de carnero. Normal : 70 – 80%. 6. Medición de la actividad citotóxica de los LTCD8+ y LNK frente a una célula diana. Se mide mediante la liberación de cromo 51 por las células previamente marcadas.

63 Pruebas para evaluar la inmuniad celular (6)
7. Medición de subpoblaciones de LT. Se hace usando an monoclonales marcados con fluorocromos y cuantificados por citometria de flujo. Cada población se expresa en %. 8. Evaluación e la fagocitosis usando nitroazul de tetrazolio. Si hay fagocitosis cambia su coloración e amarillo a azul intenso.

64 Pruebas para evaluar inmunidad celular (7)
9.Test de reducción de la dihidrorodamina (DHR). También se usa para evaluar fagocitosis. En los individuos sanos los fagocitos reducen la DHR a un compuesto fluorescente.

65 Pruebas para evaluar inmunidad celular (8)
10. Test de quimioluminiscencia. También para evaluar fagocitosis. En condiciones normales durante la fagocitosis se liberan radicales de oxígeno libre los cuales reaccionan con sustratos oxidables sobre los microorganismos y forman prouctos intermedios inestables que liberan energía luminosa cuando vuelven a su estado basal.

66 Pruebas usadas en la inmunología de trasplantes
Para determinar los antígenos HLA usamos: Técnica de microlinfotoxicidad. Prueba de reacción en cadena de la polimerasa ( PCR).

67 Prueba de reacción en cadena de la polimerasa
Fue desarrollada en 1983 por el Dr. Karig Mullis. Es un método para amplificar selectivamente una región dentro de una molécula de DNA. La enzima más usada es la Taq polimerasa.

68 PCR (2) Usos: Clonación de genes conocidos o genes relacionados con genes conocidos. Detectar e incluso cuantificar la presencia de determinadas secuencias de DNA en una muestra. Cuantificar los niveles de RNAm usando la transcriptasa inversa. Análisis de reordenamiento genéticos específicos.