EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE CD5 Y CD6 COMO BIOMARCADORES PRONÓSTICO EN ESTADIOS RESECABLES DE CÁNCER DE PULMÓN NO MICROCÍTICO. Andrea Moreno.

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1 EVALUACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE CD5 Y CD6 COMO BIOMARCADORES PRONÓSTICO EN ESTADIOS RESECABLES DE CÁNCER DE PULMÓN NO MICROCÍTICO. Andrea Moreno Manuel1, Silvia Calabuig Fariñas1,2,3, Fernando Aranda4, Inés Simoes4, Sheila Zúñiga5, Ana Blasco2,6, Carlos Camps1,2,6,7, Francisco Lozano4,8,9, Rafael Sirera10, Eloisa Jantus-Lewintre1,2,10. 1. Laboratorio de Oncología Molecular, Fundación para la Investigación, Hospital General Universitario de Valencia, Valencia, España 2. Centro de Investigación Biomédica en Red Cáncer, Instituto de Salud Carlos III, Madrid, España 3. Departamento de Patología, Universitat de València, Valencia, España 4. Immunoreceptors of the Innate and Adaptative System, Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer, Barcelona, España 5. Unidad de Medicina de Precisión en Oncología Traslacional, INCLIVA, Valencia, España 6. Servicio de Oncología Médica, Hospital General Universitario de Valencia, Valencia, España 7. Departament de Medicina, Universitat de València, Valencia, España 8. Servei d’Immunologia, Centre de Diagnòstic Biomèdic, Hospital Clínic de Barcelona, Barcelona, España 9. Departament de Biomedicina, Facultat de Medicina, Universitat de Barcelona, Barcelona, España 10. Departament de Biotecnologia, Universitat Politécnica de València, Valencia, España

2 Disclosure Information
Employment: Nothing to disclose Consultant or Advisory Role: Nothing to disclose Stock Ownership: Nothing to disclose Research Funding: Nothing to disclose Speaking: Nothing to disclose Grant support: Fundació La Marató TV3 ( ), ISCIII (PI and PI ), MECD (SAF R) -co- financiado por FEDER. Becas de ISCIII (Programa Sara Borrell; CD15/00016) y PFCT (SFRH/BD/75738/2011). Other: -

3 Sistema inmune y cáncer
Jantus-Lewintre & Usó, 2015 Introducción y objetivos: El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte debida a cáncer. Hoy en día sabemos que este mal pronóstico no se debe sólo a las células tumorales, sino a todo el microambiente tumoral, y que el sistema inmune juega un papel clave en la prevención desarrollo y tratamiento del cáncer. Por ello, en este trabajo nos centramos en dos genes inmunoreguladores, CD5 y CD6. SEOM, 2017

4 Sistema inmune y cáncer
CD5 y CD6: inmunocheckpoints TCR CD6 CD5 T cell CD5 y CD6 son dos receptores de superficie que se colocalizan junto al TCR en la sinapsis inmunológica, estas moléculas inmunomoduladoras, implicadas en la activación, desarrollo, diferenciación y supervivencia de los linfocitos. Por tanto, CD5 y CD6 se postulan como nuevos inmunocheckpoints, cuyo papel en cáncer no está muy definido. Inicialmente se consideraban moléculas coestimuladoras pero también se ha visto que pueden actuar como inhibidoras, e inducir la diferenciación a células T reguladoras, en función de los niveles de expresión. Por tanto, el objetivo del presente estudio es analizar la expression génica de CD5 y CD6 como posibles biomarcadores pronósticos en cancer de pulmón no microcítico. Células tumorales

5 Sistema inmune y cáncer
CD5 y CD6: inmunocheckpoints TCR CD6 CD5 T cell CD5 y CD6 son dos receptores de superficie que se colocalizan junto al TCR en la sinapsis inmunológica, estas moléculas inmunomoduladoras, implicadas en la activación, desarrollo, diferenciación y supervivencia de los linfocitos. Por tanto, CD5 y CD6 se postulan como nuevos inmunocheckpoints, cuyo papel en cáncer no está muy definido. Inicialmente se consideraban moléculas coestimuladoras pero también se ha visto que pueden actuar como inhibidoras, e inducir la diferenciación a células T reguladoras, en función de los niveles de expresión. Por tanto, el objetivo del presente estudio es analizar la expression génica de CD5 y CD6 como posibles biomarcadores pronósticos en cancer de pulmón no microcítico. Células tumorales

6 Sistema inmune y cáncer
CD5 y CD6: inmunocheckpoints TCR CD6 CD5 T cell CD5 y CD6 son dos receptores de superficie que se colocalizan junto al TCR en la sinapsis inmunológica, estas moléculas inmunomoduladoras, implicadas en la activación, desarrollo, diferenciación y supervivencia de los linfocitos. Por tanto, CD5 y CD6 se postulan como nuevos inmunocheckpoints, cuyo papel en cáncer no está muy definido. Inicialmente se consideraban moléculas coestimuladoras pero también se ha visto que pueden actuar como inhibidoras, e inducir la diferenciación a células T reguladoras. Por tanto, el objetivo del presente estudio es analizar la expression génica de CD5 y CD6 como posibles biomarcadores pronósticos en cancer de pulmón no microcítico. Células tumorales Objetivo: Analizar la expresión de genes inmunoreguladores como posibles biomarcadores pronósticos en CPNM

7 Materiales y Métodos Aislamiento ARN Transcripción inversa
N = 186 pacientes Tejido normal Random primers ARN ADN Proteínas RNA later® ARN ADNc TRI Reagent ® High Capacity RT Kit Tejido tumoral Análisis de datos RTqPCR 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜= 𝐸 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ∆𝐶𝑝 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎) 𝐸 𝑟𝑒𝑓 ∆𝐶𝑝 𝑟𝑒𝑓 (𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎) El estudio se realizó en una cohorte de prueba compuesta por 186 pacientes de CPNM en estadios resecables con muestras pareadas de tejido fresco normal y tumoral, en los que se analizó la expresión de CD5 y CD6 mediante RTqPCR. Mediante la fórmula de Pfaffl se calculó la expresión génica relativa, normalizando con tres genes endógenos. Posteriormente, se utilizó la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) para obtener una cohorte de validación independiente, compuesta de 97 pacientes con datos de expresión génica en tejido normal y tumoral. Gen Sonda CD5 Hs _m1 CD6 Hs _m1 ACTB Hs _m1 CDKN1B Hs _m1 GUSB Hs _m1 Sondas de hidrólisis

8 Materiales y Métodos Aislamiento ARN Transcripción inversa
N = 186 pacientes Tejido normal Random primers ARN ADN Proteínas RNA later® ARN ADNc TRI Reagent ® High Capacity RT Kit Tejido tumoral N = 97 pacientes Análisis de datos RTqPCR 𝑅𝑎𝑡𝑖𝑜= 𝐸 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ∆𝐶𝑝 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎) 𝐸 𝑟𝑒𝑓 ∆𝐶𝑝 𝑟𝑒𝑓 (𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎) El estudio se realizó en una cohorte de prueba compuesta por 201 pacientes de CPNM en estadios resecables con muestras pareadas de tejido fresco normal y tumoral, en los que se analizó la expresión de CD5 y CD6 mediante RTqPCR, y se calculó la expresión relativa utilizando la fórmula de Pfaffl. Posteriormente se utilizó la base de datos The Cancer Genome Atlas (TCGA) para obtener una cohorte de validación independiente con datos de expresión génica en tejido normal y tumoral. La supervivencia se determinó mediante análisis de regresión de Cox y se representaron curvas Kaplan-Meier (test log-rango) tras dicotomizar los datos tomando la mediana como valor de corte. Gen Sonda CD5 Hs _m1 CD6 Hs _m1 ACTB Hs _m1 CDKN1B Hs _m1 GUSB Hs _m1 Sondas de hidrólisis

9 Análisis descriptivo de la cohorte de prueba
Resultados Análisis descriptivo de la cohorte de prueba Características N=186 % Edad (mediana, rango): 65 [26-85] Género Masculino 158 84,95 Femenino 28 15,05 Hábito tabáquico Fumador 91 48,92 Exfumador 74 39,79 No fumador 21 11,29 Estadio I 96 51,61 II 55 29,57 IIIA 35 18,82 Estado funcional (PS) 125 67,20 1-2 61 32,80 Histología SCC 89 47,85 ADC 77 41,40 Otros 20 10,75 Grado de diferenciación Poco 47 30,52 Moderado 73 47,40 Bien 34 22,08 NS 32 QT adyuvante Sí 72 60,4 No 110 39,6 4 N=186 pacientes Recaída: 85 (45,70%) pacientes Exitus: 91 (51,08%) pacientes Mediana de seguimiento: 34 (1-133,80) meses Características N=186 % EGFR Nativo 89 89,00 Mutado 11 11,00 NS 86 KRAS 152 83,98 29 16,02 5 Este es el análisis descriptivo de la cohorte de prueba, compuesta por 186 pacientes con cáncer de pulmón no microcítico en estadios resecables, del Hospital General Universitario de Valencia.

10 Análisis de supervivencia: cohorte de prueba
Resultados Análisis de supervivencia: cohorte de prueba Variables SLR SG HR 95,0% IC p-valor Sexo Masculino vs. Femenino 0,601 0,390-0,925 0,021 1,592 0,851-2,979 0,146 Edad >65 vs. ≤65 1,150 0,795-1,662 0,459 1,378 0,919-2,065 0,120 Hábito tabáquico Fumador vs. Exfumador vs. No fumador 0,772 0,599-0,994 0,045 1,025 0,769-1,365 0,867 Estado funcional (PS) 1/2 vs. 0 1,568 1,082-2,272 0,018 1,693 1,119-2,562 0,013 Estadio II/IIIA vs. I 1,479 1,182-1,851 0,001 1,160-1,884 0,002 Tamaño tumoral >3.5 cm vs. ≤ 3.5 cm 1,381 1,054-1,811 0,019 1,303 0,963-1,764 0,086 Afectación ganglionar Sí vs. No 1,806 1,237-2,636 1,578 1,041-2,394 0,032 Histología ADC vs. SCC vs. Otros 1,086 0,805-1,464 0,589 0,941 0,678-1,306 0,716 Grado de diferenciación Poco vs. Bien/Moderadamente 1,218 0,934-1,589 0,145 1,041 0,779-1,392 0,784 Estado mutacional KRAS Mutado vs. Nativo 1,611 1,019-2,546 0,041 1,755 1,060-2,906 0,029 Estado mutacional EGFR Mutado vs. Nativo 1,038 0,471-2,287 0,927 1,008 0,428-2,372 0,986 Quimioterapia adyuvante No vs. Sí 1,856 1,252-2,729 1,587 1,049-2,402 Los análisis de supervivencia se realizaron mediante análisis de regresión univariante de Cox. En primer lugar, se analizaron las principales características clinicopatológicas, y, en concordancia con lo descrito en la bibliografía, el estado funcional, el estadio, la afectación ganglionar y el estado mutacional de KRAS son biomarcadores pronóstico tanto para la Supervivencia Libre de Recaída como para la Supervivencia Global.

11 Análisis de supervivencia: cohorte de prueba
Resultados Análisis de supervivencia: cohorte de prueba Análisis univariante SLR SG HR 95,0% IC p-valor CD5 Alto vs. Bajo 0,708 0,483-1,038 0,077 0,592 0,390-0,898 0,014 CD6 Alto vs. Bajo 0,997 0,680-1,460 0,986 0,929 0,614-1,404 0,725 p=0,076 44,30 meses 29,20 meses p=0,013 99,90 meses 49,63 meses Para analizar el valor pronóstico de los niveles de expresión de CD5 y CD6, se utilizó el análisis univariante de Cox, y se representaron las curvas Kaplan-Meier (test log-rango) tras dicotomizar los datos de expresión génica tomando la mediana como valor de corte. En nuestra cohorte de prueba, mayores niveles de expresión de CD5 se asocian con un incremento en la supervivencia. Aquellos pacientes con mayores niveles de expresión de CD5 presentan un aumento significativo de Supervivencia Global (p=0.013), por lo que CD5 es un potencial biomarcador pronóstico.

12 Estado mutacional de KRAS
Resultados Análisis de supervivencia: análisis multivariante Variables SLR SG HR 95,0% IC p-valor Estadio IA/IB vs. IIA/IIB vs. IIIA  1,565 1,219-2,010  0,0004 1,625 1,234-2,139 0,001 Estado mutacional de KRAS Mutado vs. Nativo 2,126 1,280-3,531 0,004 2,054 1,134-3,723 0,018 Estado funcional (PS) 1/2 vs. 0 1,661 1,102-2,504 0,015 1,800 1,148-2,823 0,010 CD5 Alto vs. Bajo 0,554 0,360-0,853 0,007 Para confirmar el valor pronóstico de CD5, realizamos un análisis de regresión multivariante de Cox, en el que se incluyeron todas aquellas variables que habían resultado significativas en los análisis de supervivencia anteriores. Junto con el estadio y otras características clinicopatológicas, este análisis nos permite establecer CD5 como biomarcador pronóstico independiente, con un p-valor de y una Hazard Ratio de 0.554, lo que nos indica que aquellos pacientes con mayores niveles de expresión de CD5 tienen 2 veces menos probabilidad de exitus. Bajos niveles de expresión de CD5  2X probabilidad de exitus

13 Análisis descriptivo de la cohorte de validación
Resultados Análisis descriptivo de la cohorte de validación N=97 pacientes Características N=97 % Edad (mediana, rango): 67 [45-86] Género Masculino 52 53,61 Femenino 45 46,39 Hábito tabáquico Fumador 23 23,71 Exfumador No fumador 22 22,68 Estadio I 53 55,21 II 28 28,12 IIIA 16 16,67 Histología SCC 44 45,36 ADC 54,64 Afectación ganglionar Si 35 37,63 No 58 62,37 NS 4 Tamaño tumoral T1 26 26,80 T2 65 67,01 T3 6 6,19 Recaída: 27 (32,14%) pacientes Exitus: 46 (47,42%) pacientes Mediana de seguimiento: 28 (1,11-120,46) meses Para validar estos resultados, tomamos los datos de 97 pacientes con CPNM de la base de datos TCGA.

14 Análisis de supervivencia: cohorte de validación
Resultados Análisis de supervivencia: cohorte de validación Variables SLR SG HR 95,0% CI p-valor Sexo Masculino vs. Femenino 2.497 1,373-4,542 0,003 2,252 1,212-4,185 0,010 Edad >65 vs. ≤65 1,495 0,836-2,670 0,175 1,773 0,954-3,295 0,070 Hábito tabáquico Fumador vs. Exfumador vs. No fumador 0,820 0,586-1,148 0,248 0,708 0,502-1,000 0,050 Histología ADC vs. SCC 0,582 0,333-1,016 0,057 0,606 0,338-1,086 0,092 Estadio II/IIIA vs. I 1,798 1,028-3,146 0,040 2,024 1,125-3,642 0,019 Afectación ganglionar Sí vs. No 1,544 0,875-2,726 0,134 1,807 1,002-3,258 0,049 Tamaño tumoral T2/T3 vs. T1 2,339 1,093-5,006 0,029 1,842 0,855-3,969 0,119

15 Análisis de supervivencia: cohorte de validación
Resultados Análisis de supervivencia: cohorte de validación HR = 0,513 HR = 0,530 Los análisis de supervivencia realizados en esta cohorte de validación muestran que aquellos pacientes con mayores niveles de expresión de CD6 presentan un incremento significativo tanto en SLR como SG, por lo que a pesar de que no había resultado significativo en nuestra cohorte de prueba, CD6 es un potencial biomarcador pronóstico que debería ser validado en otras cohortes de pacientes. Las curvas de supervivencia de CD5 de esta cohorte de validación, confirman la asociación con valor pronóstico de CD5, tanto para SLR como para SG, lo que permite validar los niveles de expresión de CD5 como biomarcador de buen pronóstico. HR = 0,542 HR = 0,537

16 PEOR PRONÓSTICO MEJOR PRONÓSTICO
Conclusión Biomarcador pronóstico en CPNM en estadios resecables CD5 biomarcador pronóstico independiente Fenotipo no inflamado Fenotipo inflamado CD5 Células tumorales Células tumorales Células T CD4+ Células T CD8+ No infiltración Células dendríticas Conclusión: Como resumen, estos análisis han permitido el establecimiento de CD5 como biomarcador pronóstico independiente para Supervivencia Global en estadios resecables de CPNM, y podemos concluir que los niveles de expresión intratumoral de CD5 y CD6 afectan a la respuesta inmune antitumoral, y, en concordancia con resultados previos del laboratorio, mayores niveles de expresión de genes inmunoreguladores se asocian con mejor pronóstico. Por lo contrario, tal como podemos ver en estas imágenes de inmunohistoquímica, aquellos pacientes cuyos tumores presentan un fenotipo no inflamado, también conocido como desierto inmune, presentan un peor pronóstico. Por último, comentar que este trabajo es parte de un estudio realizado en colaboración con el laboratorio de IDIBAPS, en el que están realizando una caracterización exhaustiva de las moléculas CD5 y CD6, y que también se va a estudiar su potencial como dianas terapéuticas. No respuesta inmune Inmunoregulación Mejor respuesta inmune PEOR PRONÓSTICO MEJOR PRONÓSTICO Usó et al., Oncoimmunology 2017 Usó et al., Oncotarget 2017

17 ¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!
Agradecimientos Oncología médica Alfonso Berrocal Ana Blasco Mª José Safont Cristina Caballero Mª José Godes Vega Iranzo Francisco Aparisi Mireia Gil Miriam Lobo Alberto Cunquero Cirugía torácica Ricardo Guijarro Eva García del Olmo Enrique Pastor Cora Sampedro Anatomía patológica Miguel Martorell Atilio Navarro Investigación clínica Vicente Castellano Paula Matoses Ana Saval Lola Serra ¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN! Laboratorio de oncología molecular Carlos Camps Eloisa Jantus Silvia Calabuig Rafael Sirera Sandra Gallach Eva Escorihuela Marais Mosqueda Elena Duréndez Alejandro Herreros Héctor Amado Ning Dong Feiyu Zhang Sara Principe Valentina Dikova Laboratorio IDIBAPS: Fernando Aranda, Inés Simoes, Esther Carreras, Francisco Lozano.