“AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCION E IMPUNIDAD” INTEGRANTES: -Colan Paredes Diego -Cumpa Ortiz Maryori -De la Cruz Licas Pamela -Pichiluingue -Romero.

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1 “AÑO DE LA LUCHA CONTRA LA CORRUPCION E IMPUNIDAD” INTEGRANTES: -Colan Paredes Diego -Cumpa Ortiz Maryori -De la Cruz Licas Pamela -Pichiluingue -Romero Castrejón Andrés -Usquiano Zavala Esthefany PROFESOR : Mg. Lisly Sedano ANALISIS INSTRUMENTAL 2019

2 CROMATOGRAFÍA La cromatografía es un método químico de separación para la caracterización de mezclas complejas cuyo objetivo es separar los distintos componentes, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia; es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

3 FUNDAMENTO La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil.

4 FASE MÓVIL La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución migran de acuerdo a las interacciones no covalentes de los compuestos de la columna.

5 LA FASE ESTACIONARIA (SILICA) La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna.

6 -Velocidad de análisis -Alta resolución -Resultados cuantitativos -Buena sensibilidad -Automatización -Amplio espectro de aplicaciones -Instrumentación costosa -Difícil análisis cualitativo -No existe detector universal y sensible -Elevado costo de operación -Experiencia indispensable VENTAJAS DESVENTAJAS

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8 Aplicaciones: Compuestos iónicos Aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos orgánicos, etc. Compuestos de alto peso molecular Polímeros, hidrocarburos polinucleares, productos naturales, etc. Compuestos termolábiles y no volátiles Vitaminas, pesticidas, esteroides, drogas.

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11  Integrados: Cada una de sus partes están reunidas en un gabinete y su intercambio o conexión con otros componentes es difícil.  Modulares: Los módulos son instrumentos individuales que permiten no solo armar el equipo según las necesidades, sino aumentar su complejidad según esa necesidad varíe.

12 COMPONENTES PRINCIPALES Instrumentación 1)Reservorio. Contiene a la Fase Móvil. 2)Bomba. Impulsa a la Fase Móvil dentro del sistema de elución de HPLC. 3)Inyector (Automuestrador o Manual). Permite introducir la muestra al sistema. 4)Columna (Precolumna, Guardacolumna y Horno). Sistema de análisis. 5)Detector. Es un transductor que tiene como función el registro del paso de componentes de una muestra en el orden en el que eluyen. 6)Colector de Fracciones. Sirve para recibir o contener por separado los componentes que ya eluyeron por si se requiere un análisis posterior de alguno de ellos. 7)Computador. Sistema de almacenamiento.

13 1.- CONSIDERACION DE RESERVORIO  Frasco cerrado de vidrio o de algún polímero resistente al disolvente con paredes homogéneas.  Contiene un filtro de metal poroso que ayuda a retener partículas de tamaño mayor a 10μm.  Previo al bombeo del disolvente hacia el sistema de HPLC, se realiza un tratamiento por desgasificación por ultrasonicación o un burbujeo con un gas inerte (He excelencia). Consideraciones del Disolvente El disolvente debe ser de alta pureza (grado HPLC). Disolver el analito. Tener baja viscosidad. No debe reaccionar con el empaque de la columna. Debe ser volátil. Polaridad adecuada para el tipo de análisis que se lleve a cabo.

14 Impulsan a la FM hacia el sistema de HPLC. Generan presiones de hasta 6000 psi (lb/in2). Tienen flujo libre de pulsaciones, evitando así la variación de presión dentro del sistema. Tienen intervalos caudal de 0.1 a 10 ml/min. Tipos de bombas Binarias: Impulsan un solo disolvente hacia el sistema. Secundarias: Impulsan 2 disolventes hacia el sistema. Terciarias: Impulsan 3 disolventes hacia el sistema. Secundarias: Impulsan 4 disolventes hacia el sistema. Principio de la bomba reciprocante 2.- BOMBAS

15 Elución Isocrática Se mantiene la misma proporción de disolventes durante todo el proceso. Elución en gradiente La proporción de la mezcla de disolventes cambia en algún punto del proceso. Este tipo de elución se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja de componentes con polaridad diferente.

16 3.- INYECTOR Permite introducir la muestra al sistema de HPLC para su análisis sin despresurizar el sistema y sin interrumpir el caudal La muestra se introduce en el “ Loop ”, el cual se encarga de introducir la muestra al sistema. Tiene una posición de carga y otra de inyección. Septum Microjeringas de Inyección Válvula muestreadora Generalmente se usa una válvula muestreadora con jeringa.

17 4.- COLUMNA Y PRECOLUMNA Es el medio donde se lleva a cabo la separación y es el contenedor de la FE Las precolumnas deben contener la misma FE que el empaque de la columna, este evita el posible ingreso de partículas contaminantes y en general prolonga la vida media de la columna. COLUMNAS DE VIDRIO PRECOLUMNAS Elución: el soluto es lavado de la columna por agregado de solvente

18 Diámetro interno 3.9 - 4.6 mm Longitud de 10, 15, 25, 30 cm Tamaño de partícula de 3.5, 5, 10 μm CARACTERISTI CAS DE COLUMNAS

19 Detectores

20 5.- Detector UV/VIS Se encarga de translucir la energía emitida de un compuesto. Funciona únicamente para compuestos que absorban en UV/VIS. Puede utilizarse en gradiente de elución. Es altamente selectivo sobre posean que compuestos dobles enlaces. Regiones de absorción de luz

21 TIPOS DE HPLC Según el fenómeno dentro de la columna

22 SEGÚN MECANISMOS DE SEPARACIÓN

23 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN Equilibrios de adsorción-desorción de los componentes. Fuerza de adsorción (depende de la polaridad de este, la actividad del adsorbente y la polaridad de la fase móvil. Se usa en compuestos de polaridad baja y media

24 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

25 CROMATOGRAFÍA POR TAMAÑO MOLECULAR

26 CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL:

27 CROMATOGRAFIA FASE REVERSA

28 Parámetros De Medición La cantidad de muestra que se puede cargar a la columna y también influye en su sensibilidad. Las columnas de diámetro interno más grande (>10mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos para su utilización posterior. Diámetro Columnas HPLC

29 En cambio, las columnas de diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que conllevan.

30 se realizan con una fase estacionaria unida al exterior de partículas esféricas de silica. Estas partículas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5µm de diámetro las más utilizadas. Medida De Las Partículas

31 Tamaño Del Poro Los poros pequeños proporcionan una mayor superficie mientras que los poros de mayor medida proporcionan una cinética mejor, especialmente para los compuestos de tamaño más grande TIPOS DE POROS

32 La presión de las bombas es variable según el modelo y fabricante, pero su rendimiento se mide en su habilidad para generar un flujo constante y reproducible. La presión puede lograr valores de hasta 40 MPa Presión del sistema Bomba reciproca

33 CARACTERISTICASHPLCUPLC Tamaño Partícula3-5µ<2µ Presión Máxima35-40Mpa100Mpa ColumnasAlltima c18Acquity UPLC BEH C18 Dimensión De Columnas150x3.2 mm150x2.1 mm Temperatura De Columnas 30 ℃ 65 ℃ Volumen De Inyección5µL5µL2µL2µL Rendimiento De MuestraMenorMayor Preparación De MuestraSimpleTedioso Coagulación De ColumnaNo toma lugarToma lugar Tiempo de AnálisisMayorMenor SensibilidadMenorMayor

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42 El HPLC es elegido debido a su alta sensibilidad, rapidez, versatilidad y a la capacidad de detectar muchas sustancias como: aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, drogas, esteroide, plaguicidad y alguna sustancias de origen inorgánico Para una buena interpretación del cromatograma debemos tener presenta el significado y lo que representa cada variable como el tiempo muerto, el tiempo de retención, etc.

43 GRACIAS