Resistiendo el estrés oxidativo: La travesía de Trypanosoma cruzi

Presentación del tema: "Resistiendo el estrés oxidativo: La travesía de Trypanosoma cruzi"— Transcripción de la presentación:

1 Resistiendo el estrés oxidativo: La travesía de Trypanosoma cruzi
a la infección

2 Ciclo de vida de Trypanosoma cruzi
Tomado de “The Trypanosoma cruzi Proteome” Atwood III et al; Science Vol 309; 2005

3 Respuesta inmune innata
1- Respuesta celular Activación de macrófagos residentes, células de Langerhans y NK Producción de interleuquinas proinflamatorias 2- Sistema del complemento Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno

4 Rol central de los macrófagos en el control de la infección
Fagocitosis como primera línea de defensa contra la infección por T. cruzi

5 Interacciones Macrófagos - T cruzi
2 O2 + NADPH  2 O2• – + NADP H+ Rápida activación de la NADPH oxidasa durante la fagocitosis 8 min Villalta et al, 1984 Alvarez, MN et al, 2007

6 Óxido Nítrico Sintasa Actvadores: IFN-γ, TNF-α, IL-1β, IL-6,
productos derivados de patógenos (virales, bacterianos y de protozoarios) Inhibidores: IL-4, IL-10, IL-13, TGF-β Interacción con células apoptóticas

7 - ONOO O2 RNH2 O2● _ H2O2 NO2¯ OH¯ OH● NO3¯ 2 H2O +
Peróxido de Hidrógeno OH● Radical Hidroxilo H2O2 2 H2O O2 Especies Reactivas del Oxígeno NADPH oxidasa OH¯ SOD + 1e- O2● _ ● NO Óxido Nítrico NO2¯ Nitrito Dióxido de Nitrógeno ● NO2 NO3¯ Nitrato RNH2 L-Arginina - 1e- i NOS Especies Reactivas del Nitrógeno Peroxidasa/H2O2 (MPO) - 5e- Superóxido (anion radical) peroxinitrito ●NO2 + CO3●¯ ONOO ONOOH ●NO2 + OH● H+ CO2 ONOOCO2¯ -

8 Oxidantes intrafagosomales
Macrófago no estimulado 2 hrs de infección

9 Oxidantes intrafagosomales
Macrófago estimulado con IFN-ϒ 2 hrs de infección

10 Citotoxicidad de macrófagos contra Tripomastigotas
rol del ONOO- en el control parasitario 20 40 60 80 100 Infección (%) Apocinina O2●- * +●NO Amastigotas intracelulares

11 Defensas Antioxidantes en T. cruzi

12 Las peroxiredoxinas de Trypanosoma cruzi tienen actividad peroxinitrito-oxidoreductasa in vitro
(10 3 M-1s-1) (10 3 M-1s-1) NADPH TR ox T(SH)2 TXNox TcCPXRed ONOOH 10 6 M-1s-1 + NADP TR red TS2 TXNred TcCPXOx NO2- TR = tripanotiona reductasa T(SH)2= tripanotiona TXN = triparedoxina TcCPX= triparedoxina peroxidasa citosólica Trujillo et al, 2004

13 Resistencia de TcCPX a la citotoxicidad
mediada por ONOO- Células Control Células Control + ONOO- TcCPX + ONOO-

14 Resistencia de cepa TcCPX
20 40 60 80 100 120 Infección (%) Tc CPX salvaje O2●- ONOO- * Infección en macrófagos In vitro Infección en ratones In vivo Días post-infección Tripomastigotas en 50 campos

15 Evaluación in vivo

16 Caracterización de las cepas
TCC CL-WT

17 Contenido de Enzimas Antioxidantes
TcCPX TcMPX TcTS Contenido relativo de enzima Epimastigotas de 3 días Tripomastigotas Metacíclicos Anticuerpos específicos

18 Enzimas antioxidantes: factores de virulencia
Contenido relativo de enzima (tripomastigota metacíclico) Tripomastigotas en 100 campos Tripomastigotas en 100 campos

19 Respuesta inmune innata
1- Respuesta celular Activación de macrófagos residentes, células de Langerhans y NK Producción de interleuquinas proinflamatorias 2- Sistema del complemento Activación del complemeto sobre la superficie del patógeno

20 Muerte Celular Programada en T. cruzi
Estímulo de muerte: suero humano fresco (SHF) CTL SHI SHF Control SHF Ctl SHF Tinción de núcleos apoptóticos Fragmentación ADN Exposición de fosfatidil-serina Activación del complemento sobre la superficie del parásito, Influjo de Ca2+ y disfunción mitocondrial Irigoín, F et al., 2009

21 O2- como mediador de la MCP
Smith and Murphy, 2003 HE Mito-Hidroetidio (Mitosox) Detección de O2- mitocondrial en T. cruzi Dimetoxi naftoquinona (DMNQ)

22 O2- mitocondrial como mediador de la MCP
Exposición a suero humano fresco MitoSOX oxidado Tinción nuclear

23 Protección de la MCP por Fe-SOD
Sobreexpresión de la Fe-SODA Control TcSODA SHI SHF SHF SHI bp 2 O2• – H O2 + H2O2 k = 109 M-1 s-1

24 Parásitos apoptóticos en el huesped vertebrado
Infección in vitro Cardiomiocitos Infección in vivo Corazón(14 dpi) Macrófagos peritoneales Souza EM et al., 2003 Cell and Tissue Research.

25 Activación Clásica Peluffo et al., 2004 Trends in Parasitol. 20(8)-363

26 Activación Clásica Activación Alterna Peluffo et al., 2004
Trends in Parasitol. 20(8)-363

27 Determinantes de la eficiencia de la infección
por Trypanosoma cruzi Establecimiento temprano de una respuesta proinflamatoria con inducción de la iNOS en macrófagos Niveles de enzimas antioxidantes en los tripomastigotas metacíclicos Presencia de parásitos apoptóticos en el inóculo infectivo

28 PERSPECTIVAS Búsqueda de inhibidores específicos que interfieran
con la red antioxidante de Trypanosoma cruzi en vistas a un tratamiento coadyuvante Evaluación de la MCP en nidos de amastigotas dilucidando las señales que llevan a la inducción del proceso de muerte

29 Departamento de Bioquímica María Noel Alvarez Gonzalo Peluffo
Florencia Irigoín Madia Trujillo Carlos Robello Rafael Radi Colaboración Internacional Shane Wilkinson Martin Taylor John Kelly Paola Zago Miguel Basombrio Howard Hughes Medical Institute PEDECIBA (Uruguay) CONICYT (Uruguay) PDT (Uruguay)