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INMUNOHEMATOLOGIA APLICADA
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Identificación de anticuerpos irregulares
Dr. Carlos Alberto González
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Tema 1: Cuándo identificar anticuerpos
Tema 2: Para qué sirve identificar anticuerpos Tema 3: Cómo identificar anticuerpos Pre-analítico Analítico Post-analítico
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Inicio de sección
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SOLO SE DETECTA POR REACCIÓN HEMOLÍTICA POST TRANSFUSIONAL
No existe ningún método para detectar el error en la identificación de un anticuerpo SOLO SE DETECTA POR REACCIÓN HEMOLÍTICA POST TRANSFUSIONAL
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Identificación de anticuerpos irregulares
1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? 2) ¿Para qué sirve identificar anticuerpos? 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos?
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Identificación de anticuerpos irregulares
1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? Prueba de Antiglobulina Indirecta Negativa Positiva Prueba Cruzada Negativa Si hay registro previo de PAI+ seleccionar GR Antígeno Negativo Identificar el Ac Efecto de Dosis Anti-LebH, -H, -IH Positiva Incompatibilidad ABO Donante PAD+ Ac Baja Incidencia Identificar el Ac Seleccionar GR Antígeno Negativo y cruzar
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Identificación de anticuerpos irregulares
1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? 2) ¿Para que sirve identificar anticuerpos? Para asignar significado clínico Para buscar anticuerpos adicionales en aloinmunizados
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Identificación de anticuerpos irregulares
Anticuerpo capaz de producir: 1) Hemólisis post transfusional 2) Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal 3) Daño en el tejido trasplantado Para asignar significado clínico 9
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Dr. Carlos Alberto Gonzalez
Identificación de anticuerpos irregulares Incidencia: 2 % pacientes 1 o más Ac clínicamente significativos. 98 % NO presenta Ac CS 8,4 % desarrollan Ac entre 2 y 24 sem de transfundido. 76 % son Ac del Sistema Rh (vox sang 1996; 71: 216) Para asignar significado clínico Curso Básico de Inmunohematologia Básica y Aplicada en Medicina Transfusional
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Significado clínico de los aloanticuerpos
Importantes Solo si + a 37º C A veces Benigno ABO Rh Kell Duffy Kidd S, s, U Vel Lea M, N P1 Lutheran A1 Yta Ge Gya Hy Sda Knops Chido/Rogers Xga HLA/Bg, Csa, Yka, McCa JMH Para asignar significado clínico Curso Básico de Inmunohematologia Básica y Aplicada en Medicina Transfusional 11
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Reacción Hemolítica/Serológica Post-Transfusional
ISBT Science Series 2012; 7: 54-57
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Identificación de anticuerpos irregulares
Implicancia en Enfermedad Hemolítica Feto Neonatal Clínicamente no significativo Clínicamente Significativo Leve Severa o Moderada Anti-A1, -Kpa, Anti-M (no activo a 37º C), –N, Anti-P1, -Lea, -Leb, -Lea+b, -Lua, -I Anti-e, -E, -Dib Anti-Fyb, -Jkb, Anti-M, -S,-s, Anti-C, -Fya, -Jka, Anti-M (activo a 37º C), Anti-S, -s,–Dia Anti-D, Anti-c, Ac Sist Kell Para asignar significado clínico
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Identificación de anticuerpos irregulares
1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? 2) ¿Para qué sirve identificar anticuerpos? 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Pre-analítico Analítico Post-analítico
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Identificación de anticuerpos irregulares
Diagnóstico Tratamiento Etnia Registros previos 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Pre-analítico
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Pre-analítico Autoinmunes, onco, infecc PAD/PAI +; hemólisis
Drepanocitosis, talasemia > Frecuencia aloAc Diagnóstico Hipergammaglobulinemia PAD+ no significativa C. GR Campo mixto, RHPT Tx < 3 meses Tratamiento Pl, C pqt, hd PAD/PAI +; discrepancias Drogas PAD/PAI +; hemólisis 16
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Pre-analítico Etnia Asociación con fenotipos negativos
Registros previos Discrepancias ABO, sensibilización 17
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Pre-analítico Etnia Asociación con fenotipos negativos Etnia FENOTIPO
FRECUENCIA Afroamericana U- Negativo; Js(b-) 1/100 Fy(a-b-) 68% Americanos / Orientales Di(b-) <1/100 Caucásica K+k-; Lu(a+b-); Co(a-) 1/500 Kp(a+b-) 1/5.000 Polinesia Jk(a-b-) 1 c/110
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Dr. Carlos Alberto Gonzalez
Pre-analítico Etnia Asociación con fenotipos negativos Frecuencia de fenotipo E-, C-, Fy(a-), K-, Jk(b-) en donantes: 7% caucásicos 93% afroamericanos Curso Básico de Inmunohematologia Básica y Aplicada en Medicina Transfusional
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Pre-analítico Etnia Asociación con fenotipos negativos
Unidades Incompatibles Anticuerpos más frecuentes Caucásica Afro-americana Oriental Algunas -K, -Lua -K, -Kpa -K, -Dia La mitad -Jka, -Fya, -E -Jka, -E, -Fya La mayoría Rh-: -D Rh+: -c, -Fyb Rh+: -c -c Casi todas -e, -k, -Yta, -Lub -e, -U, -Jsb, -Fy3 -e, -Yta Todas -Kpb, -Vel, -Lan -Hy, -Joa, -Ata -Dib, -Jkab
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Desconocido (muestra)
Identificación de anticuerpos irregulares Conocido (reactivos) Desconocido (muestra) Pruebas Detección e Identificación de Anticuerpos Paneles globulares Suero Tipificación eritrocitaria Reactivos séricos Hematíes 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Pre analítico Analítico
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Analítico Muestra: Plasma vs suero (tiempo de extracción)
Reactivos globulares Poliespecífico vs monoespecíficos Suero Antiglobulina (SAG) MBFI – PEG – ENZ – ALB – CAT – fase sólida Potenciadores
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Analítico Paciente transfundido entre (en días)
Muestra: Plasma vs suero (tiempo de extracción) Paciente transfundido entre (en días) Muestra a ser tomada antes de transfundir (no más de) 3 -14 24 horas 15 -28 72 horas 1 semana
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Analítico Panel selector Panel Identificador Detección de Anticuerpos
Muestra: Plasma vs suero (tiempo de extracción) Reactivos globulares Panel selector Panel Identificador Detección de Anticuerpos 2 vs 3 células Células homocigotas Identificación de Anticuerpos 8, 10, 11 o más células Versión extendida del selector
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Fenotipo donante 10 tiene 9 antígenos presentes:
Panel Identificador Cada frasco del panel corresponde a un donante tipificado para los antígenos mas importantes (mostrado en cartilla) + presencia del antígeno ausencia del antígeno Donantes son Grupo O Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 10 AC Fenotipo donante 10 tiene 9 antígenos presentes: c, e, k, Jka , Fya, Leb, M y s
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Panel Identificador Autocontrol
Autocontrol vs Prueba de Antiglobulina Directa (PAD) Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 10 AC Negativo Aloanticuerpo Autocontrol Autoanticuerpo Reacción hemolítica post transfusional Positivo Aloanticuerpo GR + suero Campo mixto
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Panel Identificador Mismas fases que detección de anticuerpos
LIS: Lectura inmediata a temperatura ambiente: IgM 37°: Lectura post incubación a 37o C: IgG o IgM alto rango térmico SAG: Lectura en medio antiglobulina humana: IgG Rh LIS 37º C SAG CC D C E c e 1 + 2 3 4 CC: Control de Coombs
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Fase LIS Realizar la lectura inmediata en salino y leer aglutinación, hemólisis (puntuación) Registrar los resultados en su columna: Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 Hasta el ultimo tubo
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Negativo 1+ 2+ 3+ 4+ Hemólisis
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No deben ser tachadas al excluir.
Potencia de las reacciones Fases de reacción Reacción en Fase única Varía c/ ≠ Fase Anticuerpos múltiples Homogénea c/ todas las células Varía c/ ≠ células Efecto de dosis Anticuerpos múltiples IgM + IgG (?) Anticuerpo único Heterocigotas: reacciones Débiles o negativas Homocigotas: reacciones intensas IgM + IgM IgG + IgG No deben ser tachadas al excluir. 32
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Fase a 37°C Se continúa con lectura a 37º C y se registran los resultados Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC
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Fase SAG Se continúa con prueba de antiglobulina, se registran los resultados Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC
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Todas las células negativas en SAG, agregar “Control de Coombs”
Fase SAG Todas las células negativas en SAG, agregar “Control de Coombs” Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC
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Aglutinación en 4 tubos … y ahora?
Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC
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Interpretación de los resultados
Pasos “Exclusión” tachar los antígenos que no reaccionaron Marcar los antígenos no tachados Considerar el medio/fase óptimo de reacción del anticuerpo Buscar la clave patrón
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Los individuos NO desarrollan anticuerpos contra sus propios antígenos
Interpretación de los resultados Pasos “Exclusión” tachar los antígenos que no reaccionaron Regla de Landsteiner: Los individuos NO desarrollan anticuerpos contra sus propios antígenos
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Interpretación de los resultados
Pasos “Exclusión” tachar los antígenos que no reaccionaron Un anticuerpo solo reaccionará con eritrocitos que tengan el correspondiente antígeno; los anticuerpos no reaccionarán con eritrocitos que no tengan el antígeno
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1. Exclusión Tachar los antígenos que NO REACCIONARON en ninguna fase; y NO tachar los heterocigotas (efecto de dosis) Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC
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2. Marcar los antígenos no tachados
Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC
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3. Considerar el medio/fase óptimo de reacción del anticuerpo
Anti-Lea es un IgM fría reactiva en LIS. Anti-E es IgG reactivo a 37º C /SAG Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC
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Interpretación: anti-Lea
4. Buscar la clave patrón Anti-E no es patrón y es un Ac caliente Interpretación: anti-Lea Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC
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Regla de 3 Para confirmar el anticuerpo debe cumplirse la Regla de 3
El valor de p debe ser ≤ 0.05 Esto da un 95% intervalo de confianza ¿Cómo demonstrarlo? El suero del paciente debe reaccionar: Positivo con 3 hematíes que portan el antígeno Negativo con 3 hematíes sin el antígeno Usando células adicionales
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Regla de 3 1, 4, 7 y 9 son positivas para el antígeno y reaccionan
2, 3, 5, 6, 8 y 10 son negativas para el antígeno y no reaccionan Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2+ 2 3 4 5 6 7 8 9 10 AC 4 células positiva 6 células negativas
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Tipificación La tipificación del antígeno de los hematíes confirma la especificidad del anticuerpo Realizarlo si el paciente no ha sido recientemente transfundido: Separación de neocitos Biología molecular
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Múltiples anticuerpos
Procedimientos para identificar múltiples anticuerpos Células adicionales Adsorción (autóloga / homóloga) Neutralización Modificar los hematíes Enzimas proteolíticas Agentes sulfidrílicos AET
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Múltiples anticuerpos
anti-Jka , anti-S y anti-P1 Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 4+ 2 3 2+ 4 3+ 5 6 7 8 9 10 AC
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Múltiples anticuerpos
Células adicionales: anti-Jka, anti-S y descartan anti-P1 Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P LIS 37º C SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 4+ 2 3 2+ 4 3+ 5 6 7 8 9 10 AC #1 #2 #3
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GR autólogos si se sospecha autoAc + aloAc
Gr con Fenotipo conocido Descartar sobrenadante Elución por calor Dispensar los GR en 3 tubos: 1 2 3 Muestra con Ac múltiples Para absorciones adicionales Centrifugar Detección / Identificación de Anticuerpos Suero adsorbido Prueba Cruzada Incubar Descartar GR 51
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Neutralización Sustancias: P1 (líquido de quiste hidatídico)
Lea y Leb (plasma y saliva) I (leche materna) Sda (orina) ** Muchas sustancias neutralizan anticuerpos fríos (IgM); que pueden enmascarar IgG clinicamente significativa
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Múltiples anticuerpos
Anti-K y anti-Fya Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2 3+ 3 2+ 4 5 6 7 8 9 10 AC Patrón anti-Fya
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Múltiples anticuerpos
Patrón anti-K Anti-K y anti-Fya Rh Kell Kidd Duffy Lewis MNS P SAG ENZ SAG CC D C E c e K k Jka Jkb Fya Fyb Lea Leb M N S s P1 1 + 2 3+ 2+ 3 4 5 6 7 8 9 10 AC Patrón anti-Fya Potenciados por enzimas Desnaturalizados por enzimas Las enzimas remueven el ácido siálico y modifican antígenos
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Ac no identificado con panel convencional
Homogénea en fases y medios Varía c/ ≠ células Varia c/≠ fases Efecto de dosis 1 célula + Todas las células + adsorción c/ GR de ≠ fenotipo NO SI GR suero vs. Ac hacia Ag Baja incidencia Titular KELL, LU, YT, CO, DI, SC Identificar en sobrenadante y eluído Ac HTLA GR neg Ag alta Incidencia y GR cordón GR ENZ, AET, DTT cloroquina NO SI Tipificación Extendida Inhibición de hemaglutinación Ac hacia Ag alta incidencia Mezcla de Ac Compleja
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3) ¿Cómo identificar los anticuerpos?
Prueba de antiglobulina indirecta R1R1 y anti-E seleccionar E y c negativo R2R2 y anti-C seleccionar C y e negativo Negativa Positiva Identificar el anticuerpo Prueba cruzada convencional Clínicamente no significativo Clínicamente significativo Anti-A1, -Kpa, Anti-M (no activo a 37º C), –N, Anti-P1, -Lea, -Leb, -Lea+b, -Lua, -I Anti-D, -C, -c, -E, -e Anti-K, -k, -Fya, -Fyb ,-Jka, Jkb Anti-S, -s, U, -M (activo a 37º C) No es necesario tipificar las unidades 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Tipificar las unidades (aun si en el futuro la PAI es Negativa) Prueba cruzada Post analítico
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Post-analítico Unidades necesarias a cruzar Un anticuerpo
Paciente con un anti-Jka necesita 4 unidades, ¿cuántas unidades necesito cruzar para encontrarlas? Jk (a+) = 77% Jk (a-) = 23% Si 23 Jk(a-) ……. 100 donantes 4 Jk (a-) …… X = Se necesitaran probar 17 o 18 unidades para encontrar 4 Jk(a-) 100 x 4 = 17,4 23
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Post-analítico Unidades necesarias a cruzar
Anticuerpos múltiples Por ejemplo: paciente con anti-K y anti-Jka, necesita 2 unidades compatibles Jk (a+) = 77% Jk (a-) = 23% K+ = 9% K- = 91% Jk(a-) (0.23) x K- (0.91) = 0.20 Jk(a-) y K- 20% de los individuos son Jk(a-) K- Se necesitan 10 donantes al azar para encontrar 2 compatibles
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Identificación de anticuerpos irregulares
1) ¿Cuándo hay que identificar los anticuerpos? PAI+ Prueba Cruzada + 2) ¿Para que sirve identificar anticuerpos? Significado clínico Ac adicionales 3) ¿Cómo identificar los anticuerpos? Pre analítico Antecedentes Analítico Exclusión / “regla de 3” Post analítico Cruzar y tipificar GR
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Gracias… e-mail del presentador
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