BIOPSIA EMBRIONARIA PRODUCIDO IN VITRO Ing. M.Sc. Misael Rodriguez

Presentación del tema: "BIOPSIA EMBRIONARIA PRODUCIDO IN VITRO Ing. M.Sc. Misael Rodriguez"— Transcripción de la presentación:

1 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA DOCTORADO EN CIENCIA ANIMAL TÉCNICAS DE INVESTIGACIÓN EN REPRODUCCIÓN ANIMAL Profesor: Ing. Mg. Enrique Alvarado Malca Alumno: Misael Rodríguez Capcha IN VIVO TRANSFERENCIA DE EMBRIONES PRODUCIDOS IN VIVO EN VACUNOS Lima, 08 de Mayo de 2018

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3 1. Resumen (Objetivo) 2. Introducción (Antecedentes) 3. Materiales y métodos 4. Resultados y discusiones 5. Conclusión Contenido:

4 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 1. Resumen (Objetivo) in vivo in vitro Evaluar el efecto de la biopsia en embriones de vacunos producidos in vivo (IVV) e in vitro (IVP) sobre la tasa de preñez (TP)

5 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 1. Resumen (Objetivo) 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 8000007000006000005000004000003000002000001000000 Gráfico publicado por Blondin (2015) datos de la IETS (2015-2017) In vitro In vivo

6 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 2. Introducción (Antecedentes) Mejora genética (MG) caracteres cuantitativos (leche, carne). Usa registros fenotípicos y genealogía (pedigrí) de cada animal, VALOR DE CRIA Mejora genética (MG) caracteres cuantitativos (leche, carne). Usa registros fenotípicos y genealogía (pedigrí) de cada animal, VALOR DE CRIA Interés de usar marcadores genéticos para seleccionar con mas precisión y acelerar el progreso genético Genoma del vacuno (1980), desarrollo SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Selección Genómica (SG): Selección merito genético predicho (BIOPSIA) Genoma del vacuno (1980), desarrollo SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Selección Genómica (SG): Selección merito genético predicho (BIOPSIA) > Ganancia Genética/tiempo SNPs-SG + IVP IVV e IVP Limitaciones en el manejo de los embriones producidos IVV e IVP  Proceso Biopsia embrionaria (EB)  Cantidad y calidad de ADN a extraer IVV e IVP Limitaciones en el manejo de los embriones producidos IVV e IVP  Proceso Biopsia embrionaria (EB)  Cantidad y calidad de ADN a extraer

7 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 2. Biopsia embrionaria (EB) EB (extracción de ADN), no es técnica nueva, usado para determinar el sexo en vacunos, ovejas, caballos y cabras Hace 20 años aprox. Los investigadores en TE utilizaban la EB en combinación del PCR (Polymerase Chain Reaction) para determinar el sexo La EB en IVV parece no tener efecto sobre la viabilidad postbiopsia (desarrollo e implantación normal) Plasticidad temprana del embrión EB a los 3-4-5 días Post IA La EB en IVV parece no tener efecto sobre la viabilidad postbiopsia (desarrollo e implantación normal) Plasticidad temprana del embrión EB a los 3-4-5 días Post IA Estudios reportan diferencias entre embriones IVP (frágiles, sensibles a la biopsia) e IVV SNPs-SG + IVP >>> Ganancia genómica / tiempo Estudios reportan diferencias entre embriones IVP (frágiles, sensibles a la biopsia) e IVV SNPs-SG + IVP >>> Ganancia genómica / tiempo Como realizar la EB tanto en IVV e IVP sin que disminuya su viabilidad (TP) ?

8 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 3. Material y métodos (diseño experimental) IVV (MOET) IVP (OPU) Cultivados por 3Hrs antes de TE IVP-b (91) IVP-c (227) IVV-b (380) IVV-c (229) Transferencia ipsilateral al CL en las receptoras sincronizadas Holstein: 22 Jersey: 08 Holstein: 22 Jersey: 08 Gyr: 29

9 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión in vivo (IVV) 3. Producción de embriones in vivo (IVV) 7 Días Sincronizar onda folicular Día 10 IATF (2) Semen congelado Día 0 BE:2 mg IM CIDR: 1.9 g v Dosis decrecientes, dos veces por día Superovulacion Día 8 CIDR: retiro GnRH: 25 µg Inducción de la ovulación Día 4 FSH/LH: 500 UI-H FSH/LH: 375 UI-J Día 6 PG 2a : 25 mg IM 12 y 24 Hrs Día 17 Lavado TR: 90-95 % Clasificación de acuerdo IETS Grado I y II (Mc, Bi, BL y Be) Clasificación de acuerdo IETS Grado I y II (Mc, Bi, BL y Be)

10 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión in vitro (IVP) 3. Producción de embriones in vitro (IVP) COCs Grado: I-II OPU Folículos 3-8 mm TCM-199 + Sal de earle + 10% SFB + 0.01IU/mL FSH-LH + 0.1mg/mL L-glutamina + 0.075 mg/mL antibióticos MADURACIÓN - 200 µL MM 22 Hrs – 39°C – 5% CO2 FIV - 100 µL MF 18 Hrs – 39°C – 5% CO2 TALP + Penicilina(2mM) + Hipotaurina(1mM) + Epinefrina(250mM) + Heparina (10mg/mL) SPZ mótiles (Percoll 90-45%) Centrifugado: 700 g x 15 min 1 x 106 SPZ/mL 7 Días post FIV, se clasificó de acuerdo manual IETS. Grado I y II (Mc, Bi, BL y Be) 0 a 7 días se incubo en medio SOF (200 µL) a 39°C, 5% CO2 7 Días post FIV, se clasificó de acuerdo manual IETS. Grado I y II (Mc, Bi, BL y Be) 0 a 7 días se incubo en medio SOF (200 µL) a 39°C, 5% CO2

11 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 3. Biopsia de embriones (EB) Biopsia de los embriones IVV - IVP Transferencia a receptoras sincronizadas Micromanipulador (placas petri c/ medio Holding) Trofoblasto (10-20 blastómeros) Solución de Lisis (Prot K) PCR múltipe: dos primers (X-Y) Electroforesis en gel de agarosa Teñido c/ Bromuro de etidio UV Macho (2 amplicones) Hembra (1 amplicon) IVV-b y IVP-b se mantuvieron en holding medio x 3 Hrs antes de TE Transferencia ipsilateral al CL 7 días después del estro Sincronización se hizo con BE (2 mg-im) y CIDR, 7 día coprostenol y retiro CIDR. TP(%): 30 – 60 dias Post TE

12 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 3. Biopsia de embriones (EB)

13 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión Las tasas de preñez (TP) y el efecto de la biopsia embrionaria (IVV - IVP) en la preñez, se evaluaron mediante la prueba de Chi cuadrado. Se consideraron diferencias significativas cuando P< 0.05 3. Análisis estadístico

14 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 4. Resultados y discusiones Tasa de preñez (TP) en IVV-b y IVV-c La EB no afectó la viabilidad (TP) de los embriones IVV (P>0.05) No se observo diferencias entre IVV-b y IVV-c para la perdida embrionaria a día 60 (P>0.05)

15 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 4. Tasa de preñez (TP) en IVV en diferentes etapas TP (%) en embriones biopsiados en la etapa de Bi >>>Mc (P<0.05) Pero fue similar a todas las dos etapas (BL y Be) Los IVV-c (Mc, Bi, BL y Be) no mostraron diferencias en la TP (P>0.05)

16 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 4. Tasa de preñez (TP) en IVP-b y IVP-c TP (%) similares entre los IVP-b y los IVP-c (P>0.05) TP (%) similares para IVP-b y IVP-c biopsiados en etapas de Bi, BL y Be

17 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 4. Determinacion del sexo por PCR en IVV-b y IVP-b <10% de las biopsias (N=362) no fueron adecuadas para determinar el sexo de los embriones. IVV-b: 168 hembras (69.14%) y 75 machos (30.86%) de un total de 343 PCR. IVP-b: 48 hembras (55.17%) y 39 machos (44.83%) de un total de 87 PCR.

18 Resumen Introducción Material y métodos Resultados y discusiones Conclusión 5. Conclusiones Los resultados indicaron que la biopsia no afecta la viabilidad de los embriones bovinos IVV y IVP y puede usarse en programas comerciales para asociar tecnologías de reproducción asistida con selección genómica De las biopsias analizadas, alrededor del 90% determinaron el sexo, lo que confirma que el ADN estaba allí y se amplificó de manera eficiente y que puede usarse para otros análisis genéticos (SG).

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20 UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA DOCTORADO EN CIENCIA ANIMAL TÉCNICAS DE INVESTIGACIÓN EN REPRODUCCIÓN ANIMAL Profesor: Ing. Mg. Enrique Alvarado Malca Alumno: Misael Rodríguez Capcha IN VIVO TRANSFERENCIA DE EMBRIONES PRODUCIDOS IN VIVO EN VACUNOS Lima, 08 de Mayo de 2018