TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Presentación del tema: "TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR"— Transcripción de la presentación:

1 TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Química Biológica Patológica TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR II- Parte Aplicadas al diagnóstico de Enfermedades Genéticas 2017  Dra. Silvia Varas Tema:1 (b)

2 GENERALIDADES

3 Nomenclatura Hebras de ADN !
Cadena Codificante, Informativa, sens o cadena (+) Secuencia publicada en Gene Bank! 5’ 3’ 3’ 5’ Cadena Molde, no-codificante, no-informativa, antisentido (anti sens) o cadena (-)

4 TIPOS de SECUENCIAS en el ADN GENOMICO
Altamente repetitiva: VNTR, STR Medianamente repetitiva: Secuencias Alu, trasposones (LTR), RNAr, histonas, telomeros. DNA copia única Genes estructura exon-intron. SC Altamente Repetitivo Medianamente Repetitivo Copia Unica DC

5 Enzimas de Restricción
Cuando una bacteria es invadida por un organismo que contiene ADN, por ej por un virus, se puede defender con las enzimas de restricción (ER), denominadas también como endonucleasas. ER reconocen una corta secuencia de ADN en forma especifica y corta ambas hebras. La secuencia de reconocimiento es un palíndrome. ER son bautizadas con el nombre de la bacteria donde se aisló, mas un número de secuencia (por ej. Eco RI).

6 Denominación ER: ej: EcoRI Endonucleasa de Restricción
5’….GAATTC.….3’ ….CTTAAG…. Denominación ER: ej: EcoRI la 1º enzima hallada Escherichia coli Genero Especie R13 Cepa 6

7 La Frecuencia de la presencia de la secuencia hexamérica:
5’….GAATTC.….3’ ….CTTAAG…. La Frecuencia de la presencia de la secuencia hexamérica: 1/4096 (4-6) Al azar 7

8 Digestión del ADN con endonucleasa EcoRI
(Fragmento mayor) (Fragmento más pequeño) Considerar una molécula de ADN linear con 6 copias de GAATTC: habrá 7 fragmentos los cuales se podrán separar por tamaño en un gel de electroforesis. 8 Digestión del ADN con endonucleasa EcoRI

9 Las diferentes enzimas reconocen y cortan el ADN genómico en distintas frecuencias
EcoRI reconoce la secuencia hexamérica: 4-6 Sau3A1 reconoce la secuencia tetramérica: 4-4 9

10 Enzimas Restricción Sub-unidades Catalíticas Sub-unidades Reconocimiento

11 Ejemplo: (Eco RI) (corta) 5’ – GAATTC – 3’ 3’ – CTTAAG – 5’

12 Los enzimas de restricción son proteínas homodímericas
y reconocen secuencias de DNA palindrómicas BamHI G ' GATCC SITIO INESPECÍFICO SITIO ESPECÍFICO

13 TIPOS DE CORTE PRODUCIDOS POR E. RESTRICCIÓN
Extremos cohesivos 3’ Extremos romos Extremos cohesivos 5’

14

15 Condiciones a tener en cuenta en la hibridización:

16 Definiciones Una probe o sonda es un secuencia de oligonucleótidos simple hebra y esta marcado con radio isótopo (32P) o fluorescente. Su secuencia es complementaria a la secuencia de interés, cuya secuencia es conocida. Hibridización: unión por apareamiento de bases de dos moléculas de acido nucleico. Tm: Temperature melting= temperatura a la cual las hebras de un duplex están disociadas en un 50%.

17 DESNATURALIZACIÓN DEL DNA
1. Composición de bases 2. Longitud DNA doble 3. Fuerza iónica

18 Factores que afectan la velocidad de hibridización
Longitud del acido nucleico. Composición de base. Fuerza iónica. Viscosidad. Temperatura Agentes desnaturalizantes. pH

19 Longitud del acido nucleico. Composición de base.
K  longitud Composición de base.  % CG aumenta la re-asociación Fuerza ionica.  Na aumenta la re-asociación Viscosidad Moléculas pequeñas (glicerol, sacarosa): disminuye la velocidad de re-asociación. Polímeros de alto PM (PVP, Dextran, Ficoll): aumenta la velocidad de re-asociación.

20 Agentes desnaturalizantes.
Temperatura A  Temp  se rompen las uniones puentes de Hidrogeno. Se define como la t° óptima de hibridización a aquella donde la velocidad de hibridización es máxima. Y es gralmente 25ºC por debajo de la T° de melting. Agentes desnaturalizantes. Formamida: Baja la T° óptima de hibridización de 0,72°C cada 1% pH A una [NaCl] de 0,4M la velocidad de hibridizaciónes independiente del pH (en un rango de 5-9).

21 Polimorfismo genético
LOCUS POLIMORFICO: es una variante muy común que se encuentra en más del 1% de los cromosomas de la población en general. MUTACION

22 Sin embargo, los términos "mutación" y "polimorfismo", a menudo conducen a confusión debido a suposiciones incorrectas acerca de los efectos patógenos de la “mutación” y benignos del “polimorfismo”. Se propone por lo tanto sustituir ambos términos por el término “variante” con los siguientes términos modificadores: (i) patogénica, (ii) probablemente patógena, (iii) significado incierto, (iv) probablemente benigna, o (v) benigna.

23 SNP: Polimorfismos de nucleótido único
Los SNP son comunes y ocurren una vez cada 1000 pares bases. Marcarían la susceptibilidad a una enfermedad mas que su causa directa

24 Los Polimorfismos nucleótido único (SNPs) son secuencias en el genoma que difieren en un solo par de nucleótidos entre una porción de la población y otra. Cuando 2 alelos se comparan y hay solo 1 nt de diferencia se llama SNP, (pronunciado como snips) (single nucleotide polymorphisms). Hay mas de 10 millones de SNP Se han identificado mas de 6 millones de SNP Hay 1 SNP/1000 pb.

25 Polimorfismo de Restricción
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

26 RFLPs Condición: La presencia de una mutación es ligada a un polimorfismo de restricción La mutación y el polimorfismo no deben estar separados a una distancia mayor de 106 nucleótidos para que sean coheredados juntos.

27 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Como se puede detectar un RFLP? a) Por técnicas de Southern Blotting Extracción de ADN Digestion con la Enzima de Restricción apropiada Separación de los fragmentos por electroforesis y transferencia a membrana (Southern Blotting) Hibridización con la Sonda o Probe especifica, revelado. Análisis de los resultados

28 C B A

29 PCR: PRINCIPIOS PCR es un sistema no celular de clonado del ADN

30 Kary Mullis, el inventor de la PCR fue premiado en 1993 con el Premio Nobel en Química

31 El ciclo de amplificación de PCR
Cada ciclo requiere tres pasos de temperaturas para completar un ronda de la síntesis de ADN.

32 Paso 1: Desnaturalización del DNA
Esto ocurre a ºC

33 Paso 2: Annealing o Unión de Primers
Reverse Primer Forward Primer Los cebadores se unen a la secuencia complementaria sobre DNA target.

34 Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C)
Calculo de Tm Tm ºC = 2(nº A + T) + 4(nº G + C) Ejemplo: S- IGFI: AGC CTC GAC AGC CTG CCC CAG G Tm ºC = 2( 4 + 2) + 4( ) Tm ºC = 2(6) + 4(16) Tm ºC = = 76 Tm = 76 ºC

35 Paso 3: Extensión o “Primer Extension”
5’ 3’ extension 3’ 5’ extension 3’ 5’ DNA polimerasa cataliza la extensión de la hebra en sentido 5’3

36 Amplificación Exponencial
Ciclos Copias 1 2 4 16 10 1.024 15 32.768 20 25 30

37 Fases en una reacción de PCR
El producto de PCR se acumula en función del número de ciclos. Se distinguen las siguientes fases: La fase exponencial  hasta cerca del ciclo 30 esta bajo las condiciones estándar de reacción. La  fase plateau  resulta de cantidades limitantes de enzima y/o reducción actividad enzimática.

38 Causas del Efecto Plateau
Agotamiento de los sustratos (dNTPs o primers). Estabilidad de los reactivos (dNTPs o enzima) particularmente a la tº de desnaturalización. Inhibición por los productos finales generados (pirofosfato, duplex de DNA).

39 El tamaño del fragmento producido en PCR depende de los primers
Reverse primer Forward primer Tamaño de los fragmentos que son amplificados

40 Ventajas y Desventajas
Rapidez Sensibilidad Fortaleza DESVENTAJA DE PCR COMO METODO DE CLONADO: Se debe conocer la secuencia Producto generalmente pequeño Infidelidad de la replicación del ADN

41 Típica reacción de PCR:
El

42 Tipos de PCR PCR-RFLP (PCR-ER) ARMS-PCR MAS-PCR
PCR- SONDAS ASO (DOT BLOT) GAP-PCR MUTAGENESIS MEDIADA POR PCR