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TALLER SUBREGIONAL SOBRE ASEGURAMIENTO DE CALIDAD Y VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS
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Es la confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista VERIFICACIÓN Es la confirmación mediante el aporte de evidencia objetiva de que se han cumplido los requisitos especificados Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

VALIDACION DEL METODO Es el proceso para establecer las características de funcionamiento y limitaciones del método y la identificación de influencias que pueden cambiar estas características y hasta que punto; cuando el método se desarrolla sin un problema particular previsto Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

DISEÑO VALIDACION Protocolo evaluado y autorizado por el Supervisor
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS Protocolo evaluado y autorizado por el Supervisor Definición de la aplicación, propósito y alcance del método Sustancias y matrices Materiales, patrones y reactivos especificados DISEÑO VALIDACION Cualitativo o cuantitativo, LD, LC, rango lineal, precisión y exactitud Características de equipos Diseño de experimentos Parámetros de rendimiento y criterio de aceptación Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJECUCION Experimentos de pre-validación
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS Experimentos de pre-validación Método aprobado incluirlo en el Manual de Procedimientos Analíticos EJECUCION Ajustar parámetros del método POE para ejecutar el método en la rutina Ajustar criterios de aceptación Realizar experimentos de validación interna en forma completa Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Criterios para aceptación datos y revalidación. Requisitos seguridad. Conclusiones Experimentos y resultados Control calidad, Curva de calibración, Incertidumbre Objetivo y alcance (aplicabilidad, tipo) Preparación muestra, estadística y cálculos INFORME Sustancias y matriz Parámetros del método y críticos Se confrontan los parámetros estadísticos del método obtenidos, o bien las medidas de validación (cartas de control, ensayos de intercomparación) con lo establecido, en forma de informe final (planilla ad hoc). Puede ocurrir que uno de los puntos del informe no concuerde con lo establecido en la instrucción de trabajo correspondiente a ese método de ensayo (por ejemplo repetibilidad del 7% en vez del 5% exigido) y que de todas maneras, se considere el método adecuado. Esto debe ser fundamentado en el ámbito de la validación por el responsable del ensayo Drogas, reactivos, patrones y controles Controles de calidad patrones y drogas Lista equipos y requisitos funcionamientos y rendimiento Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

FORMATO PROCEDIMIENTO DE VALIDACION
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS FORMATO PROCEDIMIENTO DE VALIDACION En todas las hojas en el encabezado o al pie de página debe constar los siguientes datos: Organismo Laboratorio Título: Validación de..... Código: PP (Procedimiento particular número) Página 1 de Versión: 1 Fecha de entrada en vigencia: Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

FORMATO PROCEDIMIENTO DE VALIDACION
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS FORMATO PROCEDIMIENTO DE VALIDACION CONTENIDO Objetivo Alcance Areas afectadas Responsabilidades Relaciones Desarrollo Registro y Archivo Anexos Histórico Referencias Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

SUSTANCIAS que se pueden determinar MATRICES y en la presencia de qué interferencias CONDICIONES NIVELES DE PRECISIÓN y EXACTITUD que se pueden lograr Proceso para verificar que un método es ADECUADO para ese PROPÓSITO Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

VALIDACIÓN DE INSTRUMENTAL Proceso para establecer que un instrumento opera según la especificación Se logra mediante calibración o control del funcionamiento Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

ADECUADO PARA EL PROPÓSITO Proceso de medición que le permiten al usuario tomar decisiones técnica y administrativamente correctas para un propósito preestablecido BUENOS RESULTADOS ANALÍTICOS Pueden identificarse 6 principios de la práctica analítica, los cuales cuando se implementan simultáneamente, conducen a una buena práctica Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Mediciones analíticas deben satisfacer requisito acordado 2. Utilizar métodos y equipos probados que aseguren son aptos para un determinado propósito 3. Personal que realiza las mediciones competente y calificado 4. Verificación externa y periódica de la competencia técnica del laboratorio 5. Mediciones analíticas realizadas en un laboratorio consistentes con las que se realizan en otro 6. Quienes efectúan mediciones analíticas deben tener POE de control de calidad y de aseguramiento de la calidad Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Razones para validar un método Si el resultado de un ensayo no es confiable, no es útil y es mejor no realizarlo El cliente recurre a un laboratorio porque necesita resolver un problema y confiar en los resultados El analista tiene que garantizar que los resultados son adecuados para el uso destinado, para resolver el problema del cliente y expresados de manera que él pueda entenderlos y utilizarlos para tomar decisiones Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Razones para validar un método cont. La validación del método demuestra que el método utilizado es adecuado para el propósito Implica que se conoce el comportamiento del método, que se evalúa la incertidumbre, de modo que el usuario esté seguro del grado de confianza que puede tener el resultado Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Acciones para validar un método Conjunto de pruebas utilizadas para establecer que un método es apropiado para un determinado propósito Está implícito que los estudios se realizan utilizando equipos que cumplen con las especificaciones, que funcionan y que están calibrados correctamente; que el operador está capacitado para tomar decisiones apropiadas durante los estudios Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Criterios según categoría de método Categoría I: cuantificación de materia prima o principio activo en producto terminado Categoría II: determinar impurezas en materia prima o compuestos de degradación en producto terminado y análisis de residuos en material biológico o alimentos Categoría III: determinar las características de funcionamiento como disolución o liberación de droga Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

CRITERIOS SEGUN CATEGORIA Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Criterios según tipo de método Método Normalizado Modificación de Método Normalizado Método Interno Comprobar que el Laboratorio domina el ensayo y lo utiliza correctamente Exactitud Repetibilidad Incertidumbre Límite de Detección (si la Norma lo indica) Reproducibilidad No difieren del método original Son suficientes para el objetivo de aplicación Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Método Normalizado Modificación de Método Normalizado Método Interno Determinar: Intervalo de trabajo Linealidad Recuperación Robustez Selectividad Estabilidad Reproducibilidad Reproducibilidad Exactitud Repetibilidad Límite detección Límite cuantificación Rrecuperación Sensibilidad Incertidumbre S E G U N M T O D Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

En todos los casos Realizar Carta de control con los resultados de materiales de referencia Controles Intralaboratorios Participar en ensayos interlaboratorios Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EXACTITUD Es la cantidad que se refiere a las diferencias entre la media de una serie de resultados o un resultado individual y el valor que se acepta como verdadero o valor correcto, para la cantidad medida [IUPAC Compendium of Chemical Technology, 1985]]] Proximidad entre el resultado de una medición y el valor verdadero Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Analizar un MRC con matriz igual a la muestra Si no hay MRC realizar ensayo de recuperación, mínimo 10 repeticiones del ensayo 3 días consecutivos Comparar el promedio de los valores obtenidos (X) con el valor de referencia certificado, considerar la incertidumbre del material. La diferencia da el sesgo del método: s = X - MRC Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

VALOR Valor aceptado que sirve como referencia de comparación previamente acordado y el cual deriva de: A. Establecido o teórico, basado en principios científicos B. Asignado o certificado, basado en el trabajo experimental de organizaciones nacionales e internacionales C. Consensuado o certificado, basado en trabajo experimental colaborativo D. Cuando a), b) y c) no es posible, la medición de una cantidad [ISO 3534-] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

VALOR VERDADERO Es el consistente con la definición de una cantidad particular dada [VIM 1993] VALOR VERDADERO CONVENCIONAL Atribuido a la cantidad particular y aceptada, algunas veces por convención, que tiene una incertidumbre adecuada para el propósito dado Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

PRECISION Es la proximidad entre resultados de análisis independientes obtenidos bajo condiciones estipuladas Depende sólo de la distribución de los errores aleatorios y no se relaciona con el valor verdadero o valor especificado. Se computa como desviación estándar de los resultados de los análisis [ISO ] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EXACTITUD Y PRECISION VALOR VERDADERO X X X X X X XXXXXX MAS EXACTO MAS PRECISO CONCENTRACION (X) Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

DESVIACION ESTANDAR Es la medida de cómo se dispersan los valores alrededor de la media en la distribución de valores: La desviación estándar  para toda la población de valores n En la práctica usualmente se analiza una muestra y no la población, la desviación estandar de la muestra esta dada por s ó DS: { (Σ (xi – x )2 /n-1}1/2 donde i: 1 a n Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

LINEALIDAD Define la capacidad del método para obtener los resultados de los análisis proporcionales a la concentración de la sustancia El Rango Lineal es por inferencia del rango de concentraciones de la sustancia en el cual el método da resultados del análisis proporcional a la concentración de la sustancia [AOAC-PVMC] Se verifica mediante la obtención de coeficientes de correlación mayores o iguales a 0,995 Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

RANGO (cont.) Determinar el intervalo de concentración de analito en el cual el método es aplicable Dentro del intervalo de trabajo puede haber un intervalo en el que la respuesta del sistema de detección es lineal. Interesa conocerlo para determinar el modo de calibración Cuando se utiliza algún tipo de instrumentación es útil considerar la sensibilidad y el umbral de discriminación Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

INTERVALO DE TRABAJO Es el intervalo entre el nivel más bajo y más alto de concentración que ha sido demostrado que puede ser determinado con la precisión y la exactitud requeridas para una determinada matriz CURVA DE CALIBRACION Es la representación gráfica de la señal de medida como una función de cantidad de la sustancia [AOAC-PVMC] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Para ello Preparar un blanco y 4 -6 concentraciones diferentes del analito o 4 -6 muestras fortificadas Representar la señal obtenida en función de la concentración y determinar el ámbito lineal y los extremos superior e inferior del intervalo de trabajo c) Repetir los pasos a) y b) dentro del ámbito lineal y efectuar un estudio estadístico de los resultados obtenidos Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

COEFICIENTE DE CORRELACIÓN Es un parámetro cualitativo, adimensional, da una idea primaria sobre la bondad del modelo lineal Para tener una idea más confiable se deben realizar análisis gráficos de residuos Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

DISCRIMINACION Es la capacidad de un instrumento de medición para responder a pequeños cambios en el valor del estímulo Puede depender del ruido (interno o externo), fricción, amortiguamiento , inercia, etc Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

SENSIBILIDAD Es el cambio en la respuesta del instrumento de medición dividido por el cambio correspondiente en el estímulo El estímulo puede ser cantidad de analizado presente También se aplica al método analítico globalmente, teniendo en cuenta otros factores tales como el efecto de los pasos de extracción y purificación [VIM 1984 y IUPAC Orange Boo AREA = 1899 ng/g Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

BLANCO El valor obtenido cuando el analito no está presente en la muestra durante la medición. Si existe una señal o valor medido para el componente se debe a factores ajenos y debe ser descontado del valor de la medición cuando ésta se realiza con el analito presente Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

CONFIRMACIÓN DE LA IDENTIDAD Establecer que la respuesta del instrumento se atribuya sólo al analito en estudio y no a la presencia de interferencias. Usar técnicas distintas Se aplica al análisis cualitativo y cuantitativo Analizar muestras, patrones y materiales de referencia por el método en estudio y otros métodos independientes Usar los resultados de las técnicas complementarias para evaluar la capacidad del método en confirmar la identidad del analito Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

SELECTIVIDAD El grado en que otras sustancias interfieren con la determinación de una sustancia de acuerdo con un procedimiento dado [IUPAC Compendium of Chemical] T Término recomendado en química analítica para expresar el grado en que un método puede determinar un analito en presencia de interferencias de otros componentes Se desaconseja el empleo del término “especificidad” para el mismo concepto, dado induce a confusión Codex Alimentarius, ALINORM 04/23] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Para ello Analizar blancos de al menos 20 matrices diferentes Analizar varias interferencias probables en presencia del analito de interés Examinar el efecto de interferencias, ver si incrementa o inhibe la detección o cuantificación del analito Si ocurre esto, es necesario trabajar más en el desarrollo del método Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

LIMITE DE DETECCION Es el contenido más bajo que se puede medir con seguridad estadística razonable [AOAC- PVMC] Es necesario sólo para decisiones cualitativas, si la sustancia está presente o no a) 3 veces la dispersión (DS) del Blanco Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

LD cont. b) 2,5 a 5 veces la relación señal/ruido del equipo de medida que utiliza c) la concentración cL o la cantidad qL, es la medida más pequeña xL que se puede detectar con seguridad razonable xL = x bl + k S bl x bl media de las medidas de las muestras blanco (MB) S bl desviación estándar de las medidas de la MB k factor numérico de acuerdo al nivel de confianza de trabajo [IUPAC, 1985] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

FALSOS NEGATIVOS/ POSITIVOS
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS FALSOS NEGATIVOS/ POSITIVOS Para métodos cualitativos, se puede determinar la proporción de falsos positivos/negativos Comparar con método confirmatorio, si es aplicable a las mismas matrices y al mismo rango de concentración FALSO POSITIVO Probabilidad que la concentración real de una sustancia en la muestra de laboratorio sea menor que el valor límite aceptado mientras que las medidas realizadas en UNA (1) o más porciones de muestra, indican que la concentración excede ese valor. Valores aceptados para esta probabilidad están entre uno (1) a cinco (5) por ciento (%) [Codex Alimentarius, ALINORM 01/24A] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

FALSO NEGATIVO Probabilidad que la concentración real de una sustancia en la muestra de laboratorio sea mayor que el valor límite aceptado mientras que las medidas realizadas en UNA (1) o más porciones de muestra, indican que la concentración no excede ese valor. Los valores aceptados para esta probabilidad están en el rango de uno (1) a cinco (5) por ciento (%) [Codex Alimentarius, ALINORM] En ausencia de un método para realizar la comparación, se deben analizar las poblaciones de muestras negativas o positivas fortificadas Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Se pueden determinar los falsos positivos/negativos como sigue a continuación: Proporción falso positivo (%)= falso positivo x 100 total negativos Proporción falso negativo (%)= falso negativo x 100 total positivos [AOAC Research-Institute - Performance tested Methods Programme] Procedure Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

LIMITE DE CUANTIFICACION Los límites de cuantificación son las características de realización que marcan la capacidad de un proceso de medidas químico para cuantificar la sustancia en forma adecuada [IUPAC Orange book] Puede establecerse como 6 ó 10 veces la DS del blanco o 3 veces el LD Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

LC (cont.) LQ = k Q x Q, donde LQ es el límite de cuantificación Q es la desviación estándar en ese punto k Q es el factor cuya inversa multiplicada por el RSD iguala al cuantificando seleccionado El valor por defecto que expresa para k Q es 10 [IUPAC Orange book] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

MATERIAL DE REFERENCIA (MR) Es el material o sustancia en el cual Uno(1) o más valores de sus propiedades son homogéneos y están bien definidos para permitir utilizarlos para la calibración de un instrumento, la evaluación de un método de medición o la asignación de valores [ISO/IEC Guide , 2.1] MR CERTIFICADO (MRC) Es el MR cuyas propiedades están certificadas con rasteabilidad a la unidad en la que se expresan y se acompaña de la incertidumbre, con la indicación de un nivel de confianza Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

RECUPERACION Es la fracción de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del análisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar, el porcentaje de recuperación (%R) se calcula %R = [(CF-CU)/CA] x 100 CF concentración de la sustancia medida en la muestra fortificada CU concentración de la sustancia medida en la muestra sin fortificar CA es la concentración de la sustancia agregada (valor teórico) en la muestra fortificada [AOAC-PVMC]] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

RECUPERACION (cont.) CF concentración de la sustancia medida en la muestra fortificada: 170 ng/kg CU concentración de la sustancia medida en la muestra en la muestra sin fortificar: 10 ng/kg CA es la concentración de la sustancia en la muestra fortificada (valor teórico): 200 ng/kg %R = [( )/ 200] x 100 = [(160)/ 200] x 100 = 80 Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

REPETIBILIDAD Es la precisión bajo las condiciones de repetibilidad, es decir, los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método en muestras idénticas en el mismo laboratorio por el mismo operador utilizando el mismo equipamiento dentro de intervalos cortos de tiempo [ISO ] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

REPETIBILIDAD (cont.) Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

REPRODUCIBILIDAD Es la precisión bajo las condiciones de reproducibilidad, es decir, los resultados de análisis independientes se obtienen con el mismo método en muestras idénticas en distintos laboratorios con diferentes operadores, usando distintos equipos Se requiere la especificación de las condiciones cambiadas, se puede expresar en forma cuantitativa en términos de dispersión de los resultados [ISO ] Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

CRITERIOS DE ACEPTACION CONCENTRACIÓN g/kg REPETIBILIDAD REPRODUCIBILIDAD > 1000 μg/kg < 14% < 19% > 100 μg/kg 1000 μg/kg < 18% < 25% > 10 μg/kg  100 μg/kg < 22% < 34% > 1 μg/kg  10 μg/kg < 32% < 46%  1 μg/kg < 36% < 54% Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Intervalo de Confianza (IC)
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS Intervalo de Confianza (IC) A partir de los estimadores obtenidos en un método se puede establecer entre qué límites se encontrará el verdadero parámetro con una probabilidad preestablecida Estimador  DS del estimador común para todos los estimadores IC de la Media: raíz(DS2/n) < μ < raíz(DS2/n) Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO 95% 5%

Pruebas de significación para el aseguramiento
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS RASTREABILIDAD Es la propiedad de un resultado de una medida o valor de un estándar por el cual se puede relacionar, con la incertidumbre establecida, a referencias establecidas, normas nacionales e internacionales (una cadena ininterrumpida de comparaciones) Pruebas de significación para el aseguramiento Test de t (distribución de la t de Student) Depende de los grados de libertad (relacionados con n) y P (nivel de confianza) µ = X ± t DS/ (n)1/2 Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

DS/ (n)1/2 Grados de libertad: n1+ n2 - 2
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS Test de t texp = X - x DS/ (n)1/ Grados de libertad: n1+ n2 - 2 Si texp < que tcrítico los resutados medios son estadísticamente equivalentes para el nivel de confianza elegido Se puede comparar Media con valor de Referencia (legislación) Dos medias Dos conjuntos de datos Equivalencia entre analistas Interlaboratorios Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Test de F (de Fisher) Se utiliza para comprobar homogeneidad de varianzas, se recomienda empezar por el test de la F Fexp = DS1 2 DS2 2 Si Fexp < que Fcrítico no hay diferencias estadísticamente significativas entre las varianzas de los dos conjuntos de datos Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Las variantes más importantes son: Carta de control de un sólo valor
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS CARTA DE CONTROL Método de elección para el control interno de rutina de métodos. No se aplica en métodos que se utilicen menos de 3 veces/mes Analizar muestra control (M incurrida o MR certificado o no) con las muestras, el resultado se registra en la carta de control Las variantes más importantes son: Carta de control de un sólo valor Carta de control del blanco Carta de control para recuperación Es necesario tener cuidado cuando se usa el término estándar dado que comúnmente se lo utiliza en DOS (2) contextos diferentes. El término puede referirse a los estándares de la medida en el sentido de material de referencia, o puede referirse a normas escritas, tales como métodos estándar. Es importante asegurarse de que esta diferencia sea clara. Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

El principio es el mismo la diferencia es el factor que se controla (contenido del analito, blanco o porcentaje recuperación) Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

INCERTIDUMBRE Parámetro asociado con el resultado de una medida, que caracteriza la dispersión de los valores que se pueden atribuir razonablemente al analizado Puede ser una desviación estándar (o múltiplo dado de ella) o la amplitud de un intervalo de confianza [VIM 1993] Imprescindible para lograr la acreditación según Norma ISO 17025 Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

INCERTIDUMBRE (cont.) Incluye los errores sistemáticos y aleatorios Para su determinación existen varias posibilidades: Indicación acerca de la repetibilidad Resultados de las cartas de control Resultado de intercomparaciones Evaluación por miembros del personal experimentados, competentes y, por lo tanto, autorizados Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Fuentes de incertidumbre a) definición incompleta de la sustancia a medir b) realización imperfecta de la definición de la sustancia c) muestreo no representativo d) efectos no conocidos de las condiciones ambientales e) desviaciones personales en la lectura de instrumentos f) límites en la discriminación o resolución del instrumento g) valores inexactos de los patrones y MR h) variaciones en mediciones de la sustancia realizadas en condiciones aparentemente idénticas Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Fuentes de incertidumbre (cont.) Condiciones de almacenamiento j) Efectos atribuibles a los instrumentos de medición, incluyendo función de calibrado, número de cifras significativas, redondeo de cifras relevantes k) Pureza de los reactivos l) Condiciones de medición ll) Efectos de la muestra (matriz) m) Corrección por blanco n) Efectos atribuibles al operador o) Efectos aleatorios Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Fuentes de incertidumbre (cont.) p) Mediciones térmicas Termómetros de referencia Instrumentos eléctricos Resolución Inestabilidad, gradientes térmicos Corrección de una escala o tabla de referencia Contribuciones del termómetro a calibrar q) Pesadas y calibración de balanzas Calibración y estabilidad de pesas de referencia Incertidumbre de la pesada: repetibilidad, linealidad, excentricidad Empuje del aire Condiciones ambientales Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Distribuciones de Probabilidad de los componentes de Incertidumbre Indican la probabilidad de que un resultado de medición tome uno u otro valor Depende de la naturaleza de cada componente Distribución normal: los resultados centrales, cerca del promedio son los más probables (X  2 DS) Distribución rectangular: todos los resultados son igualmente probables (DS = a/ 3 1 / 2 ) Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Componentes con distribución normal Distribución Normal se aplica: Cuando los desvíos menores son más probables que los mayores Cuando está explícita o implícitamente declarada (certificado de calibración) La relación entre incertidumbre estándar y expandida es 1: 2 Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Componentes con distribución rectangular Se aplica cuando no hay motivos para suponer que el valor central es más probable que los extremos Resolución de lecturas Variaciones de temperatura Exactitud declarada de equipos Pureza de materiales de referencia Cuando no se tiene información sobre la naturaleza del componente Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE Determinación de Cadmio en Alimento Alcance: se determina Cadmio en alimento en el rango de mg /kg Descripción Resumen: Se toma 0.5 g ± 0.1 mg de alimento, se adiciona 2.5 ml de ácido nítrico, después de la mineralización la solución se transfiere cuantitativamente a un frasco o redoma de 100 ml y se analiza por Absorción Atómica usando horno de grafito. La curva de calibración se realiza con patrones comerciales disponibles Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Preparación de la muestra
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Preparación de la muestra Preparación de la Curva de calibración con patrones Pesada Mineralización AA Calibración del AA Resultados Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) c0 = cantidad de Cadmio en µg/l análisis por AA VS = volumen de muestra en litro m = cantidad de muestra Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Identificar y analizar las fuentes de incertidumbre Pesada de la Muestra (Up) Volumen (Uv) Solución concentrada o stock para calibración (Ucstock) Función de Calibración Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Pesada de la Muestra (Up) Certificado de calibración de la balanza ± 0.15 mg para linalidad Esta contribución puede ser contada dos veces, una para la tara y otra para el peso, porque cada una es una observación independiente. Esto da una incertidumbre estandard de Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Volumen (Uv) 0.5 g son transferidos después de la digestión a una redoma de 100 ml Efecto del volumen: el certificado del proveedor expresa 100 ml ± 0.1 ml para la incertidumbre Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Efecto de paralaje: se realizan 10 mediciones y la DS es 0.05 100.2 100.0 99.9 : DS = 0.05 N = 10 Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Efecto de Temperatura: Temperatura ambiente 20 °C ± 3 °C Coeficiente de expansión del volumen para el agua 2.1 x 10-4 / °C Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Incertidumbre estandard de la redoma de 100 ml Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Incertidumbre del Patrón de Calibración Certificado del proveedor 1000 ± 5 mg/l Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Curva de Calibración Patrón(ug/L) 1 2 3 0.5 0.058 0.057 0.061 0.104 0.197 0.194 0.284 0.279 0.285 4 0.363 0.349 0.367 Muestra 0.07 0.068 0.069 Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Patrón ug/kg y x(ci) (ci-cort) (ci-cort)2 0.5 0.058 0.47 -1.83 3.33 0.057 0.46 -1.84 3.38 0.061 0.51 -1.79 3.21 1.0 0.104 1.01 -1.29 1.67 2.0 0.197 2.08 -0.22 0.05 0.194 2.05 -0.25 0.06 3.0 0.284 3.09 0.79 0.62 0.279 0.03 0.73 0.53 0.285 3.10 0.80 0.64 4.0 0.363 4.00 1.70 2.89 0.349 3.84 1.54 2.37 0.367 4.05 1.75 3.05 2.30 Sxx 25.22 Resultado de la muestra: 0.6 µg/l Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Incertidumbre combinada Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

INCERTIDUMBRE (cont.) Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Coeficiente de correlación r = Desviación estandar de la calibración: a = ordenada al origen b = pendiente S : DS residual B1 : pendiente p : número de medidas para determinar c0 n : número de medidas para la calibración c0 : Concentración de Cadmio determinada c : valor promedio de los diferentes patrones de calibración Sxx : Suma de cuadrados de las diferencias entre concentraciones y concentración media de patrones i : índice para el número de patrones de calibración j : índice para el número de medidas para obtener la curva de calibración Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.)
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS EJEMPLO INCERTIDUMBRE (cont.) Incertidumbre expandida: k = factor de cobertura k = 2 (95 % intervalo de confianza) Informe de resultados Cd = 0.12 ± 0.02 mg/kg Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

ROBUSTEZ La robustez de un procedimiento analítico es una medida de su capacidad para permanecer inalterado por variaciones pequeñas pero deliberadas en parámetros del método y brinda una indicación de su confiabilidad [ICH Q2A, CPMP/ICH/ 381/95] El objetivo es optimizar el método y las condiciones para obtener resultados exactos con alta seguridad, que funcione después de intervalos largos de tiempo y en otros laboratorios Un método es más robusto cuanto menos dependan los resultados de una modificación en sus condiciones Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Condiciones que afectan el método de medición: Laboratorio
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS ROBUSTEZ (cont.) Condiciones que afectan el método de medición: Laboratorio Lugar de la medición Personal Aparatos Estabilidad de Muestras, Reactivos, Solventes y Patrones Caudal de las fase móvil (en HPLC) pH de la fase móvil (en HPLC) Gradiente de temperatura (en GC) Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Estabilidad de muestras, patrones y reactivos
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS ROBUSTEZ (cont.) Estabilidad de muestras, patrones y reactivos (condiciones de almacenamiento y ensayo) Parámetros: ·Sensibilidad a la temperatura ·Sensibilidad a la luz ·Hidrólisis (por la humedad del aire) ·Facilidad de oxidación Descomposición química ·Efectos catalíticos (por las paredes del contenedor) ·Adsorción (durante la filtración de soluciones con residuos) · Precipitación (al dejar mucho tiempo una solución) Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Identificar las variables que afectan el método
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS Realizar variaciones sistemáticas en los factores “sospechosos” observar variación del resultado Identificar las variables que afectan el método Analizar MR o muestras de composición conocida Diseñar experimentos para monitorear el efecto de cambios sistemáticos en las variables Diseño factorial de experimentos Diseñar control de calidad para el control de variables críticas Clasificar variables según magnitud efecto producido Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

(s+t+u+v)/4 - (w+x+y+z)/ 4
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS El efecto de cada una de las variables se calcula haciendo la media de los 4 análisis que contienen la variable en su valor más alto (mayúsculas) y aquéllos que corresponden al valor más bajo (minúsculas). El efecto de cambio del Factor “A” a “a” se mide por la diferencia: (s+t+u+v)/4 - (w+x+y+z)/ 4 Con las 7 comparaciones (A-a,...G-g) se conoce el efecto de cada variable; cuanto > sea la diferencia > influencia tendrá La diferencia entre la media de subgrupos de 4 > que (2)1/2 DS, indica que el método es sensible a los cambios de esa variable Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

Test de Robustez de Youden para un método analítico VALOR DE LAS VARIABLES ANALISIS 1 2 3 4 5 6 7 8 A, a A a B, b B b C, c C c D, d D d E, e E e F, f F f G, g G g Resultados s t u v w x y z Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

INTERCOMPARACIONES Dan información valiosa sólo si las muestras se manejan de la misma manera que las muestras de un análisis de rutina Se realizan en intervalos de tiempo largos; por ello no son suficientes para el aseguramiento de calidad rutinario, sino que funcionan como complemento Cuanto más distintas son las matrices de las muestras de intercomparación y las del análisis, menor información del análisis rutinario Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

INTERCOMPARACIONES (cont.)
VALIDACIÓN DE METODOLOGÍA PARA ANÁLISIS QUÍMICOS INTERCOMPARACIONES (cont.) La interpretación de los resultados debe realizarse con el mayor cuidado, especialmente en el caso de resultados aberrantes o desviaciones, para obtener las mayores posibilidades de mejora Si no hay disponibles en el mercado de organismos oficiales o proveedores reconocidos se pueden realizar comparaciones con otros laboratorios Dra. Nora Angelini Consultora Internacional de la FAO

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