Roberto Fernández-Lafuente Departamento de biocatalisis

Presentación del tema: "Roberto Fernández-Lafuente Departamento de biocatalisis"— Transcripción de la presentación:

1 Inmovilización orientada de anticuerpos sobre superficies inertes para su uso como biosensores
Roberto Fernández-Lafuente Departamento de biocatalisis Instituto de Catálisis. CSIC. Madrid.

2 DETECTION OF TRACES DE ANALYTES
“Design of biosensors: new protocols to achieve a direct covalent immobilization of bio-molecules (antibodies and DNA probes) on paramagnetic particles” Cell separation Immunoassay Isolation of viruses Isolation of organelles Molecular genetics Biocatalysis ??? (insoluble substrates) concentration One step begin end of analytical protocol Magnetic particles purification DETECTION OF TRACES DE ANALYTES

3 “New general protocols for the conjugation of biomacromolecules to magnetic microspheres”
An ideal tailor-made immobilization protocol Correct orientation: Good specific biorecognization Stable attachment: Uni- o multipoint attachment Unspecific adsorption: Second antibody, target molecule, enzyme,… Spacer arms: Steric hindrances +

4 Conjugation of antibodies to magnetic particles
Correct orientation Different immobilization protocols: Simple Universal High loading capacity Very inert surface of magnetic particles

5 Immobilization of Antibodies on magnetic particles
Different Immobilization protocols: ●Random Immobilization through amino groups ●His- rich regions ●Sugar chains

6 Immobilization of Antibodies on magnetic particles:
ramdon immobilization through amino groups NH2 Br NH2 Br Primary amino groups ■Terminal amino groups ■Lys NH2 Br NH2 Magnetic particles activated with Cyanogenbromide NH2 not correctly oriented ???? unstable activated supports

7 Immobilization of Antibodies on magnetic particles: His-rich regions
NH Cu+2 COO- Highly activated magnetic particles with IDA – Cu +2 His moieties Pre-teatment of IgG not necessary Correctly oriented ???? High loading capacity Rapid and simple immobilization Mild conditions

8 Método estándar de inmovilización a soportes epóxido
PGA 1M fosfato pH 7.0 NH2 .. pH 7.0 Adsorción física (hidrofóbica) Inmovilización covalente pH 7,8 Bloqueo con

9 COO - Co +2 His His COO -

10 Immobilization of Antibodies on magnetic particles: Sugar chains
NH - NH2 + NH3 C O H Very mild oxidation of IgG Highly activated magnetic particles with controlled pK amino groups Very rapid immobilization NH3 + NH2 Correctly immobilized antibody ??? Oxidation of sugar chains present in Fc region Unaltered immunoactivity

11 BrCN IDA-Cu Sugar chain 25% 100%
Immobilization of Antibodies on magnetic particles RESULTS Immunoactivity expressed BrCN IDA-Cu Sugar chain 25% 100% Cyanogenbromide decreases immunoactivity IDA-Cu chelates-epoxide correctly orientates and mantains immunoactivity Sugar-chain correctly orientates and mantains immunoactivity

12 Immobilization of Antibodies on magnetic particles
Time (hours) % Immunoactivity Sugar chain IDA-Cu Unaltered inmunoactivity Better rate was achieved using sugar than IDA- Cu +2 Spacer arms: Sugar chain

13 Unspecific adsorption
Immobilization of Antibodies on magnetic particles Primary amino groups in magnetic particles surface + Excellent ionic exchanger Approximately 70% proteins are ionically adsorbed Charged amino in magnetic particles Unspecific adsorption

14 Adsorción inespecífica de otras biomoléculas presentes en la muestra
Inmovilización de anticuerpos a partículas magnéticas Adsorción inespecífica Soporte altamente activado muestra Analito de interés Adsorción inespecífica de otras biomoléculas presentes en la muestra Tratamiento con polímeros???

15 Colapso de las IgG inmovilizadas sobre superficies activadas
Inmovilización de anticuerpos a partículas magnéticas Colapso de las IgG inmovilizadas sobre superficies activadas + -

16 + + Superficie inerte Tratamiento con polímeros + - + - + - + -
Resultados Inmovilización Covalente y Orientada de Anticuerpos sobre Nanopartículas magnéticas aminadas Superficie inerte Tratamiento con polímeros NH2 = O = O = O NH2 + NH2 = O = O = O NH3+ NH3+ COO- C O H + - NH2 + - NH2 + NH2 + - + - NH2 NH3+

17 Dextrano-aspártico-aldehído
Resultados Inmovilización Covalente y Orientada de Anticuerpos sobre Nanopartículas magnéticas aminadas Estabilidad de los anticuerpos inmovilizados sobre nanopartículas magnéticas aminadas Dextrano-aspártico-aldehído Tampón fosfato sódico 25 mM pH 7

18 Immobilization of Antibodies on magnetic particles
Inert surface - N C _ + NH3 + NH3 + NH3 + Primary amino magnetic particles Aspartic-aldehyde-dextran Covalent attachment Blocks positive charges Heterobifunctional polymer (different molecular weights, different percentage of carboxylic groups) A first Ionic Adsorption plus an additional covalent attachment Not significant adsorption of protein

19 Anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas
Resultados Inmovilización Covalente y Orientada de Anticuerpos sobre Nanopartículas magnéticas aminadas Detección de trazas de HRP con anti-HRP inmovilizandose nanopartículas magnéticas proteína diana + Incubación Anticuerpo inmovilizado sobre partículas magnéticas otras proteínas Generador campo magnético lavados Electroforesis o determinación actividad HRP (100μl)

20 Cantidad total HRP (mg)
Resultados Inmovilización Covalente y Orientada de Anticuerpos sobre Nanopartículas magnéticas aminadas HRP IgG Cadena pesada IgG Cadena ligera Calle1 Calle 2 Calle 3 Porcentaje de la actividad HRP inicial presente en el volumen de ensayo asociada a Anti-HRP-npm. Cantidad total HRP (mg) Volumen del ensayo (L) 0.1 0.2 0.5 1 5 10 100 0.01 0.001 90 82 75 0.0001 95 88 80

21 Biótica, S.L. Bacteria LIBRE Bacterias capturadas
Xarxa Temàtica de Nanopartícules Magnètiques. Barcelona/Octubre 2.006 Bacteria LIBRE Bacterias capturadas en partículas IgG anti E.coli Partícula magnética

22 Immobilization of antibodies on magnetic particles
Results Simple and controlled microspheres surface activation Correctly oriented antibody immobilized Universal and simple protocol High yield immobilization High loading binding Inert surface: Hetero-bifunctional polymer Excellent immunobiosensor 0.01 μg peroxidase in 5 liters was fully adsorbed on 1 μg of magnetic beads containing anti-peroxidase

23 Institute of Catalysis. CSIC. Madrid. Spain
Prof. Jose Manuel Guisán Dr. Roberto Fernández-Lafuente Dr. Cesar Mateo Dr Manuel Fuentes

24 Institute of Catalysis. CSIC. Madrid . Spain

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