Inteinas Un poco de historia:

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1 Inteinas Un poco de historia:
1° Inteina (1988) entre genes homólogos de Zahoria y Levaduras. En 1990 secuencia extra del gen de levaduras se transcribió en ARNm y se eliminó de la proteína del huésped. La 1° Saccharomyces cerevisiae en gen VMA (ATPasa Vacuolar). Existen en los tres dominios de la vida. Dentro de la base de datos de inteinas hay aproximadamente 150 reportadas, en eucariotas, 289 en eubacteria y 182 en archaea. Contienen Dominio Endonucleasa que usan propagación (elementos génicos egoístas o parásitos) hallados en diferentes genes o segmentos génicos. Longitud entre 140 y 850 aa.

2 Inteinas Características: Aa definidos en los extremos (Splicing).
100 aa en cada extremo. ExtI Ct X, Int Nt (Ser, Thr, Cys), Ct (Asn), ExtII Nt (Ser, Thr, Cys). Homing endonucleasa. Respetar ORFs de las Exteinas (no deben tener Stop). Elemento regulatorio (sitio de corte > 15 nts), horizontal y vertical. Condiciones de activación. Una vez expresado genera splicing. Inteina 100 aa N t C t

3 Inteinas Mecanismo: 3’ DNA RNAm Transcripción Traducción Maduración
Exteina I Exteina II 5’ 3’ DNA RNAm Transcripción Traducción Maduración Proteína N t C t Exteina I Inteina Exteina II Exteina I / Exteina II Proteína madura DNA pol activa Ej: Codifica para DNA pol

4 Inteinas In vivo: In vitro:
Condiciones optimas pH (5-7), PR (DTT o BME), T°C (debajo de 16°C). Exteina I Inteina ATG Exteina II Western blot Ab anti-int Ab anti-ext Western blot Ab anti-ext I Ab anti-ext II Ab anti-int Exteina I Inteina ATG Exteina II Exteina I Inteina I ATG Exteina II Inteina II Western blot pH creciente T°C creciente PR creciente

5 Inteinas Splicing: Usos: 1) Expresión de endonucleasas de restricción.
Transformación, Expresión, purificación, corrida en gel y detección con distintos anticuerpos. Usos: 1) Expresión de endonucleasas de restricción. 2) Obtención de proteínas. 3) Expresión de péptidos. 4) Creación de vectores especiales. SDS PAGE Ramificada Ab MBP Inteina MBP CBP Ab QBP Ab Inteina

6 Inteinas Retengo en columna de Amilasa y trato con * * *
1) Si quiero estudiar endo en E-Coli. Retengo en columna de Amilasa y trato con distintas condiciones de PR, T°C o pH optimo para obtener la ER. 2) Obtención de proteínas sin agregados de aa. La Int debe tener Asn en el Ct y la proteína Ser, Cys o Thr en el Nt. 3) Expresión de péptidos. Se fusiona la Inteina con MBP, se chequea en gel a recién ahí se escinde y expreso pequeñas proteínas como la insulina. 4) Crear un vector que permita clonar, expresar y purificar por MB, QBP e Inteina. Inteina MBP ER * Inteina MBP Prot * Inteina Péptido MBP * Inteina MCS MBP * CBP Ct Nt Inteina MCS MBP * Nt

7 Inteinas Gracias!!!